禽流感疫苗研究进展

禽流感（Avian influenza,AI）是正粘病毒科A型流感病毒引起的一种禽类传染病。自1978年在意大利的鸡群中首次发现本病以来，已在美洲、欧洲等世界上许多国家和地区发现有本病流行。由于禽流感病毒（AIV）血清型众多，变异性强，给疫苗的研制带来极大的困难。本文将对世界上现有的几种主要禽流感疫苗及优缺点作简要综述。

　　1． 全病毒灭活苗

　　全病毒灭活苗一般是用甲醛灭活禽流感病毒鸡胚增殖的尿囊液，辅以佐剂制成的油乳剂疫苗。全病毒灭活疫苗安全性好，抗原成分齐全，免疫原性强，不会出现毒力返强和变异的危险，能够经受同种亚型AIV的攻击，给免疫鸡群提供良好的免疫保护。禽流感灭活疫苗便于储备，一旦确定AI爆发的病毒亚型，便可立即用于紧急预防接种，还可很方便地制备针对几种不同亚型病毒的多价疫苗，而且亚型抗原之间不产生免疫干扰。

　　Brugh等用4种AIV亚型制备的灭活疫苗，同只含有单一亚型的灭活疫苗相比，并没有减弱对其中任何一种亚型病毒攻击的有效保护。这为禽流感不同亚型病毒联合疫苗的开发和研制奠定了基础。Wood等用禽流感病毒A/Chicken/Pennsylvania/1307/83(H5N2)弱毒制备灭活疫苗并按不同剂量免疫SPF鸡，3周后进行强毒攻击，结果发现在一定范围内免疫剂量越大，其免疫效果越好。

　　Swayne等用10株H5亚型和1株H7亚型AIV分离株分别制成油乳剂灭活苗，免疫4周龄SPF白来航鸡，3周后用HPAIV A/Chicken/Queretaro/14588-19/95(H5N2)攻毒，结果表明所有的10种H5 AIV疫苗均能保护鸡免于发病和死亡，而H7 AIV灭活苗则不能诱导机体产生抵抗H5 HPAIV攻击的保护力；免疫后病毒分离结果阳性，说明用这些灭活苗免疫只能保护鸡在同亚型HPAIV攻击时免于发病和死亡而不能保护其免于感染；但免疫保护效力和病毒分离阳性率与疫苗株和同亚型攻毒株之间血凝素基因的同源性没有直接关系。

　　最近有研究表明，灭活的流感疫苗主要诱导小鼠的Th2型免疫应答，对不同亚型的流感病毒无交叉保护作用。若在使用灭活苗的同时使用IL-12或IL-4的抗体，则可使Th2型免疫应答选择性地向Th1型免疫应答转变，并能保护小鼠不受其他亚型流感病毒的攻击。这表明在用灭活苗免疫的同时若使用Th1型细胞因子，则可使机体产生对其他亚型的流感病毒的交叉保护力。利用细胞因子作为佐剂，对研究开发有跨亚型交叉保护作用的AI疫苗有一定的借鉴意义。

　　对于灭活苗，目前使用的佐剂主要有：矿物油、动植物油、脂质体、Avridine、ISCOMs弗氏完全佐剂等。其中Aviridine是一种巨噬细胞激活因子，具有诱导干扰素生成和增强细胞毒性T淋巴细胞杀伤力的作用。当它和脂质体相连时作用更强。Fatumbi等将Avridine应用于禽流感疫苗的研究，发现带电荷的Avridine脂质体佐剂疫苗效果最佳，它能刺激鸡体产生良好的局部免疫，与其他疫苗相比增重效果最好，攻毒2周后排毒减少，这表明Avridine具有刺激体液和粘膜免疫的功能。

　　全病毒灭活疫苗能够诱导机体产生有效的免疫应答反应，并在以往发生禽流感的过程中，成为了一种为控制疫情的进一步蔓延与扩散、减少经济损失的有力武器。但其免疫效果是由注射剂量和疫苗中的抗原含量共同决定的，在进行免疫接种时往往需要比活疫苗高出许多倍的剂量，此外还必须添加佐剂，这就大大增加了灭活疫苗的成本。同时接种灭活疫苗的机体产生针对病毒内部蛋白（如NP）的特异性抗体，干扰了临床检测和检疫以及流行病学调查，这是以灭活苗防治AIV的最大障碍。为了解决这个问题，人们又开发了其它类型的AI疫苗。

　　2． 亚单位疫苗

　　亚单位疫苗是提取AIV具有免疫原性的蛋白，并辅以佐剂而制成的疫苗。这种疫苗具有良好的安全性，能刺激机体产生足够的免疫力，但免疫保护持续时间短，且制作的成本高。由于HA基因是AIV最主要的保护性抗原基因，一般的亚单位疫苗通常是针对这种靶基因设计的。随着重组DNA及分子克隆技术的发展，将HA基因连接到载体质粒上，然后导入表达系统进行扩增和表达，可以获得大量的HA蛋白。用这种方式生产的HA蛋白不仅产量高，而且易于纯化，因而具有良好的开发和应用前景。

　　1987年Wraith用纯化的NP蛋白免疫小鼠，可保护小鼠免于流感病毒致死性感染。台湾谢快乐等用台湾AIV分离株（H8N4）的外膜蛋白HA和NA制作了免疫复合物亚单位疫苗，同时制作了灭活的油佐剂疫苗。用血凝抑制试验作为评价两种疫苗免疫效果的标准，结果表现差异不明显，只是在加强免疫时亚单位疫苗抗体升高比油佐剂苗明显。Kodihalli等用火鸡H5N2病毒的HA和NP蛋白制备的亚单位复合疫苗免疫火鸡。在免疫后21天，火鸡产生高的HI抗体滴度，并对同源或异源（H6N1）AIV的攻击产生抵抗力。在免疫后期，免疫鸡肺和气管中的病毒减少或被清除，且T细胞增殖明显并产生迟缓型超敏反应。该火鸡疫苗有潜在的应用价值。

　　另外，将AIV的基因插入杆状病毒载体，利用重组病毒在昆虫细胞中表达的AIV蛋白来制备AIV的亚单位疫苗也已研究成功。1999年，Crawford等表达H5和H7（完整基因）亚型的杆状病毒。在两种情况下，从昆虫细胞中纯化的HA蛋白在溶液中保持HA活性，形成玫瑰花环，这表明了适当的折叠，这些蛋白的免疫效果比在皮下注射油乳剂疫苗好。

　　3. 重组活载体疫苗

　　将具有免疫保护性的抗原基因重组到载体病毒中，随其在体内增殖而不断表达外源基因，可以有效诱导机体特异性免疫反应的产生，它克服了灭活疫苗和亚单位疫苗的不足，且具备弱毒疫苗的一切优点，具有良好的开发和应用前景。目前常用的病毒载体有痘病毒、疱疹病毒和逆转录病毒等。其中，痘病毒载体又包括痘苗病毒和禽痘病毒。由于痘苗病毒的宿主谱较宽，用其作载体存在野外维持、保存和散布病毒的危险。所以目前人们普遍利用对禽类致病性较弱的禽痘病毒作载体，构建重组病毒。

　　1997年，Swayne等用插入有H5 AIV HA基因的重组禽痘疫苗免疫1日龄小鸡。对免疫组和对照组分别用高致病力的毒株H5N2攻毒。所有免疫过的小鸡通过AGP试验抗体为阴性，这表明在美国免疫接种不会干扰例行的AI血清学监测程序。但是，在HA试验中，8%小鸡有低的血清滴度。对90-100%发病和90-100%死亡的在3周龄到20周龄期间的小鸡用含HA的载体疫苗接种，在大多数接种了HA载体疫苗的组别中从肠道中排毒的小鸡比对照组明显减少到50-75%，从呼吸道排的AIV的数量也减少了，而且，HA载体疫苗接种能减少高致病力的AIV传染给接种了HA-载体和对照组的小鸡。这些结果表明重组痘病毒疫苗是控制H5N2型AI的有用的工具。

　　Webster等曾用鸡痘病毒作载体分别构建表达HA基因、NP基因以及共表达NP和HA基因的重组病毒，结果是表达HA基因的重组病毒可对鸡产生100%的保护；表达NA基因的重组病毒即使在加强免疫的条件下也不能提供保护；而共表达NP和HA基因的重组病毒与单表达HA基因的重组病毒相比，免疫效果反而下降。

　　Beard曾评估了不同免疫途径对重组鸡痘病毒免疫效率的影响。他利用Deoki等构建的表达H5基因的重组病毒对鸡作翅下接种和鸡冠划种，4周后用高致病性的H5N2 AIV攻击，结果表明翅膀接种的免疫鸡群都获得了100%的保护，而鸡冠划种的鸡群则发生了50%以上的死亡。血清学检测表明，在攻毒前，接种各重组疫苗的鸡群的HI抗体效价都很低，攻毒后抗体水平明显上升。这项研究表明，以鸡痘病毒作活载体的重组基因工程疫苗翅膀刺种免疫要比鸡冠划线的免疫效果好。

　　Boyle等对此进行了更为细致的研究。他的实验研究表明，rFPV最有效的接种途径是翅翼刺种或者皮肤划种。这与许多其他研究者的结论是一致的。rFPV如果要建立大规模推广的免疫方法，例如通过饮水或喷雾途径，应该选用有较高残存毒力的FPV作为母本株来构建重组病毒。Boyle等还指出调控外源基因的启动子强度将决定有效抗原的剂量，或者会影响免疫反应的水平。

　　总之，由于重组病毒所表达的外源基因在机体内随载体病毒的复制而表达，所以同灭活苗相比，它具有免疫用量少，接种方法简便、不需添加佐剂，从而大大降低了生产成本；而且免疫保护持续时间长，免疫效果好。其最大优点是不影响用AGP法对AI疫情的监测和流行病学调查，能区分自然感染鸡群和免疫鸡群。H5亚型AIV重组禽痘病毒疫苗已获得美国农业部（USDA）的许可并在紧急情况下获准使用。H5亚型AIV HA基因重组禽痘病毒疫苗已在墨西哥禽流感爆发中使用并获得满意效果。免疫可以有效阻止群体发病，减少鸡群间疾病的水平传播，降低病毒分离阳性率，减少呼吸道及消化道排毒。

　　除此之外，也有用逆转录病毒载体构建禽流感重组病毒的报道。Brown等利用A/Chicken/Pennsylvania/1/83(H5N2) NP基因构建重组反转录病毒转移载体（pmRCAS/NP），在火鸡胚成纤维细胞上与劳氏肉瘤病毒（Rous saracoma virus）共转染获得重组病毒mRCAS/NP，并用同样方法构建了H7 HA基因的重组反转录病毒RCAS/H7，体外试验证明此重组病毒能有效表达NP和HA糖蛋白。

　　4．核酸疫苗

　　核酸疫苗是近几年新兴的一种疫苗，是利用病原的保护性抗原基因构建真核表达质粒，再将质粒DNA用肌肉注射或基因枪直接导入机体细胞，使外源基因通过机体内源性表达系统并提呈给免疫系统，诱发产生特异性的免疫应答。插入HA基因的DNA疫苗可对致死性的AIV的攻击产生免疫保护。

　　1993年Robinson等构建了用禽白血病病毒长末端重复序列启动AIV HA基因的表达性质粒。该质粒通过皮下、腹腔及静脉三种途径被导入鸡体内。首免100ng/只，一个月后加强免疫100ng/只，2-3周后攻击致死性强毒CK/VIC/85(H7N7)，剂量为100ELD50。结果是在首免和加强免疫后，HI抗体和中和抗体滴度都很低，攻毒后抗体滴度明显上升，可产生100%的保护。

　　Webster等最近用核酸疫苗免疫鸡来防治H5、H7的实验证明，在H5亚型流感病毒之间，DNA疫苗的交叉保护性好，免疫后测不出抗体，而攻毒后出现高滴度的抗体，表明活化的T细胞是DNA介导免疫保护的主要机制。实验还证明骨骼肌注射是核酸疫苗免疫的最佳途径。

　　核酸疫苗同其他疫苗相比有以下特点：核酸疫苗的抗原合成和提呈过程与病原的自然感染相似，抗原蛋白经内源性合成后转运到细胞表面，通过MHC-I类和MHC-II类分子直接递呈给免疫系统。特别是特异性CD8＋T淋巴细胞CTL的免疫反应，这些是灭活疫苗和一般亚单位疫苗不能比拟的。核酸疫苗突出优点是免疫原的单一性，只有编码所需抗原的血凝素基因被导入细胞得到表达，载体本身没有抗原性，无散毒和病原毒力返强的威胁。AI的核酸疫苗易于构建和制备，稳定性好，贮存和运输相对方便，成本较低廉。

　　然而，核酸疫苗的研制和开发才刚刚起步，还有很多的关键性问题急待解决。第一，所用载体多带有抗生素基因，导致被免疫机体可能对相应的抗生素产生抗体，给一些常见的细菌性疾病的预防和治疗带来困难。第二，目前所研制的核酸疫苗体内表达效率不够高，免疫保护力不强，这可能与核酸疫苗在机体内的生存和表达有关，有可能进入机体的大部分质粒被机体当作异物降解，只有少部分得以残存和表达，或者是载体在动物体内表达效率不高，降低了核酸疫苗的免疫效果。

　　5. 基因缺失疫苗

　　Poon LL等人最近还提出了一种新的构建流感病毒减毒活载体疫苗的策略。他们发现流感病毒的基因组RNA的5‘端有个多聚U位点，该位点是流感病毒合成mRNA的多聚A尾巴的模板。若用分子生物学的方法使编码NA的基因组RNA的多聚U位点突变为多聚A，则编码NA的mRNA带有多聚U尾巴。在被感染的细胞中，与带多聚A尾巴的mRNA不同，大部分带有多聚U的mRNA被阻滞在细胞核中。这说明mRNA的多聚A尾巴对于mRNA自身有效地转运至细胞质中至关重要。而这种NA基因发生突变的流感病毒的毒力下降，有可能被用作减毒活载体疫苗。

　　除此之外，Mason.H等还提出用植物载体来提供一种更为经济的方法产生HA蛋白。已有实验证实可食的或者口服的疫苗对禽流感的防治是可能的。另外，目前人们尝试着用动物体来表达AIV HA基因，从而出现了转HA基因的动物。

　　随着我国养禽业的迅猛发展，对禽流感的防治越来越重要。因此研制出高效、安全、生产工艺简单、价格低廉、适用的禽流感疫苗有重要意义。从上文的介绍来看，油乳剂灭活疫苗由于自身的缺陷，特别是对疾病监控所产生的不利影响，只能用于禽流感爆发时的应急免疫，来减少经济损失，而不宜作常规免疫。亚单位疫苗制作成本较高，免疫期短，不可能成为预防禽流感的理想疫苗。对于核酸疫苗的研究也才刚刚起步，尚有许多问题有待解决。目前对表达HA基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗的研究较为深入，从多个角度分析这是一种较为理想的疫苗。这种基因工程疫苗的保护效率较高，又不干扰临床检测和检疫，是极有发展前途的一类抗AIV的基因工程疫苗，有可能在生产上首先被广泛使用。但是，同时也应注意到由于AIV血清型众多，疫苗的免疫效果与疫苗株同攻毒株的同源性密切相关；并且由于重组疫苗，特别是rFPV，受母源抗体的影响很大。如何克服这些缺点，使基因工程疫苗得到广泛的推广将是今后研究的重点。