卵黄免疫球蛋白在动物生产的应用

    仔猪在3周龄以前，主动免疫系统还没有发育成熟。仔猪产生主动免疫抗体大约是3周龄以后才开始，但直到4－5周龄时，所产生的抗体仍然较少。因此，3周龄是仔猪最关键的免疫时期。一方面，因为这时由初乳和常乳所产生的被动免疫抗体水平已很少，而本身的主动免疫抗体的产生还未完全成熟。另一方面这一过渡时期恰恰是断奶仔猪的断奶应激时期，特别需要保护。许多试验显示，仔猪的提早断奶，将降低它们合成抗体的能力（Haye和Komegay，1979；Blecha和Kelley，1981），也降低细胞免疫（Blecha，等1983）。仔猪断奶的时间越早，这种影响作用越大。随着口服被动免疫的研究，家禽卵黄免疫球蛋白（IgY，immunoglobulin of yolk）已成为可以利用的热点产品。与哺乳动物免疫球蛋白相比，鸡蛋的IgY具有取材方便、提取方法简单、产量高等优点，可作为口服剂或饲料添加剂用于预防和治疗动物的早期消化道疾病，用禽卵大量制备多克隆抗体是近年来抗体制备技术中的新兴研究领域。

    1IgY的形成

    Klemperer

    （1893）发现鸡可以通过卵向幼雏转移抗体。此后，对各种抗原（细菌、病毒、蛋白质）在产蛋鸡产生的特异性抗体向卵黄中转移并蓄积的情况进行了大量研究。禽类的体液免疫系统是由腔上囊控制的。当机体受到外界特异性抗原（尤其是灭活抗原）的刺激后，诱发一系列的免疫应答反应，激发B细胞分化成能分泌特异性抗体的浆细胞，分泌大量的特异性抗体进入血液中。在产蛋禽体内，血液中的特异性抗体逐渐移行到卵巢和输卵管中，并在卵黄中蓄积起来。鸡血清中存在IgG和IgM，但鸡血液中能转移到卵黄中的免疫球蛋白只有IgG，至今卵黄中尚未发现存在

    IgA和lgM。因此卵黄中的IgG又称为卵黄抗体或卵黄免疫球蛋白（Leslie和Clem，1969）。

    IgY在种蛋的孵化过程中，随卵黄逐步被禽胚吸收进入禽胚血液中，雏禽出壳后，其血液中的IgY可为其提供强有力的被动免疫，保护雏禽免受相应疾病的早期感染。

    2卵黄中IgY含量及影响因素

    每个鸡蛋含有90－100mg总IgY，特异性IgY一般占总Igyl％－10％，即每个鸡蛋含l－10mg特异性IgY。Rose等（197）发现，卵黄中的IgY明显地高于血清中的含量，这是由于卵黄果积作用的结果。对IgY理化及生物学特性的研究证实，l个卵黄中所含IgY高达100mg。每个鸡蛋含150mg抗体蛋白质（Marquardt，1997）。Sunwoo等（1996）采用RID方法测定卵黄和水溶物（WSF）中IgY含量（见表1）。

    表1卵黄和WSF中IgY含量

    抗原部分蛋白(mg/ml)IgY(mg/ml)IgY:蛋白

    卵黄

    WSF

    WSF回收率119.2±22.2

    31．9±5.5

    26．810.5±3.3

    8．6±2.9

    81．90．09

    0．27

    沙门氏菌卵黄

    WSF

    WSF回收率131．5±20.7

    33.7±6.6

    25.611.9±3.4

    9.3±2.8

    78.20.09

    0．28

    免疫程序能影响抗体的产量（Kuby，1994），HungMin

    Chang等（1999）用抗原在大腿进行肌肉内和皮下注射研究不同免疫反应和卵黄抗体的变化，结果表明，肌肉注射组的抗体含量几乎10倍于皮下注射组。郭立君等（2001）研究表明：经静脉免疫组10d可测到特异性IgY，皮下组23d方可测出，但免疫3、4个月后，皮下组的

    IgY滴度较静脉组高（1∶6000vs1∶4000）。

    X．LI等（1998）用35周龄的单冠白来航和落岛红研究蛋重和卵黄重对IgY产量的影响，结果表明，虽然单冠白来航产蛋率、蛋重、蛋黄重都比落岛红高，但血液中和卵黄中抗一BBA抗体却一致。Yoshiko（1995）用含有26种福尔马林处理的细菌混合物作为免疫源免疫鸡生产IgY，表明IgY抑制Pseudomonas

    aeruglnoma的生长、Staphylococcusaureusentertoxin－A的繁殖和Salmonella

    enteritidis对人肠道细胞的粘附。

    3IgY分子结构和物理特性

    3．1IgY分子结构及特点

    正常鸡卵黄抗体的分子量约为180KD，等电点接近于5．2，含氮量为14

    8％。由两条重链和两条轻链通过二硫键连接在一起，呈“Y”型，其中重链约67KD，轻链约22KD。IgY的重链含4个不变区（哺乳动物IgG为3个），但没有铰链区。

    IgY的重链分子量比哺乳类IgGγ链大10KD左右，对IgY

    cDNA的分析表明，在重链结构上存在与哺乳类γ链显著不同的特点，即存在与IgEε链和IgM

    μ链相似的4个重链恒定区结构（CH1~CH4）（Makoto，1993）。在CH1与CH4之间也缺少反映铰链区的高度可动性结构特征。此外，在CH2和CH3之间存在两个重链间二硫键，在IgY

    N一门冬酸胶结合型糖链中，27．1％的糖链末端是葡萄糖键，这种特殊糖链结构在哺乳类IgG中也是不存在的。相对于重链而言，两者轻链结构的差异较小，氨基酸的相似性较大。

    与哺乳类动物（例如牛）IgG的氨基酸组成相比，牛IgG的Asx、Thr、Ser的含量较IgY中的高，而Gly、Ala和Leu含量较IgY中的低。王炯（1997）对IgY和人IgG的氨基酸组成进行了比较，人IgG谷氨酸和赖氨酸的成分略高于IgY，其它氨基酸组成无明显差别（见表2）。

    表2IgY和人IgY氨基酸含量（%）

    氨基酸IgY人IgY氨基酸IgY人IgY

    Asp7.749.85Ala6.104.23

    Thr8.058.02Gys1.761.32

    Ser11.5611.85Val8.417.58

    Glu13.7816.53Met1.240.91

    Pro2.87未测定Ile2.291.57

    Gly6.284.89Leu8.087.77

    Tyr4.245.29His2.032.40

    Phe3.735.12Ars6.684.42

    Lys4.317.99NH30.200.26

    3。2IgY物理特性

    IgY对热、酸、碱、变性剂以及蛋白酶的稳定性均较哺乳动物的IgG差。Hatta等

    （1993）对抗病毒特异性IgY的研究表明，在温度高于70℃、pH低于2－3稳定性低于兔IgG，它们的变性温度分别为73．9℃和77．0℃，这两种抗体对温度和pH稳定性不一致的原因是由于它们蛋白结构不同（见表3）。IgY在pH4.

    0－11．0时比较稳定，pH值为3．0－3．5时活性迅速下降，

    pH为12．0时活性也降低。Shimizu等（1988，1992，1993）发现温度高于75℃或pH低于3．0的酸性条件能够降低IgY的抗体活性，温度65℃时IgY活性可保持24h以上，但70℃处理90min后活性明显下降。Larsson等（1993）将IgY制剂在4℃贮存5年或在室温下放置6个月，经免疫扩散法检测，IgY活性仍无明显下降。IgY溶液在

    39．2×107Pa压力下和温度低于60℃处理30min，仍保持有活性，表明IgY有较大的抗高压能力。表3

    鸡卵黄IgY与免血清IgG的稳定性比较

    项目IgYIgG

    热稳定性70℃，15min全部变性75-80℃，15min全部失活

    热变性温度73．9℃77．9℃

    耐酸能力pH3.0全部失活PH2.0活性下降20%

    3.5M盐酸胍溶液完全变性几乎不变性

    被胃蛋白酶分解速度快慢

    Hatta等（1993）检测了3种消化道酶对抗HRVIgY的影响。将胃蛋白酶和IgY在pH2.0

    温育lh后，几乎所有的IgY丧失活性；而在pH4．0温育lh后保持91％的活性，甚至温育10h后仍有63％的活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶温育8h，活性分别保持39％和41％，这说明IgY对这两种消化酶在一定时间内有抵抗作用。

    我国学者也对IgY的特性进行了研究。汪家琦（2000）研究表明：IgY冻干粉在4℃和常温下储藏时非常稳定，可分别维持10个和6个月活性不发生显著变化。37℃时可保藏2－3个月不发生变化。IgY溶液在一10℃下冻藏时可维持6个月以上效价不会降低，但在4℃时仅维持1个月左右，在25℃和37℃下保藏时很不稳定，维持不到1个月。那红（1998）研究了IgY的稳定性，结果表明：在65℃和70℃处理20min后，分别保持90％和80％活性，而75℃时只有少量活性。在pH4－12时，IgY活性几乎不受影响。在pH4以上时，IgY对胃蛋白酶有较好的抵抗力。但IgY对胰蛋白酶十分敏感，经

    pH8．0、37℃

    lh处理后，IgY活性几乎完全丧失。龙中儿（1997）研究了温度和pH对抗人轮状病毒（HRV）的IgY的活性的影响，结果表明：IgY在温度不高于65℃的条件下仍保持其活性，70℃开始下降，至75℃时几乎失活。进一步研究发现，在65℃条件下，90min后活性开始缓慢下降，而在70℃条件下活性呈连续下降，90min后急剧下降，直至失活。在

    pH4－11，37℃

    8h后活性无明显下降，而在pH2和pH12时活性迅速下降，并且很快失活。龙中儿（1997）同时研究胃液对抗一HRV

    IgY的影响，当胃液pH为24时，抗HRVIgY活性迅速丧失，而当

    pH为42以上时，胃液作用5h后，仍保持较高活性。同时，在37℃时，pH

    2.0时酶解lh后，IgY失活，而在pH4.0或以上时，酶解5h后，仍保持较高活性，酶解后的IgY的SDS－PAGE图谱表明，IgY的重链对蛋白酶敏感，随着酶解时间推移，重链迅速消失，但轻链在图谱上显示无明显变化。在pH8．0、37℃条件下，IgY酶解8h其活性几乎没有变化。

    王炯等（1997）在pH8．0、37℃作用16h后，经15％

    SDS－PAGE蛋白电泳可见，IgY和人的IgG的重链均被消化，形成一条相同的35KD的肽段，两者的轻链虽数量有些减少但仍存在，表明胰酶的消化位点主要在重链上。IgY抗体活性有很好的耐酸性，只有pH2时活性才明显下降（见表4）。

    表4IgY酸稳定性

    pH765432

    中和滴度1∶12801∶12801∶12801∶6401∶6401∶320

    3．3IgY的保护

    抗体若要经口服途径进入机体后仍然保持有效，就要能够耐受酶的分解作用，并且能在自身功能和结构保持不变的情况下达到其发挥作用的部位。IgY对酸以及胃蛋白酶的稳定性差是其广泛应用的一个限制因素，因此有必要采取措施提高其稳定性。Shimizu等（1993）用蛋黄中提出的卵磷脂和胆固醇为壁材，用脱水一复水法（dehydration－rehydration）对IgY进行包理，形成脂质体（liposome），对脂质体包埋的IgY研究表明，在pH

    2．8条件下培养lh，通过脂质体的包埋IgY在酸性环境的稳定性显著提高。在pH1．8培养3h，lgy活性显著下降，而脂质体包理，特别在高含量胆固醇的脂质体中，很大程度保存活性。在37℃、pH

    2.8的胃蛋白酶液中lh后仍保持80％的活性，而未包理的IgY活性几乎全部丧失。而通过脂质体包理，IgY可被保护不被胃蛋白酶分解。这说明脂质体包理的IgY在胃酸性环境下稳定。

    Shimizu等（1994）发现在IgY溶液中加入30％－50％的蔗糖或转化糖可明显提高IgY在75－80℃的抗热变性和在pH3．0时的抗酸变性能力。此外，柠檬酸盐及磷酸盐对提高热稳定性也有一定效果。为提高蛋白质稳定性而对之进行多糖修饰或合成多聚物的方法也有报道。Suzuki（1984）曾用聚乙烯乙二醇修饰可以提高IgG的耐热性。汪家传（2000）研究表明：IgY在70℃以上加热时稳定性差，在pH6.5－7．5范围内稳定性最好，在高pH值和低pH值时对热不稳定。加入0．4g／ml的甘氨酸可使之在70℃加热25min时仍比较稳定。葡萄糖、山梨醇、蔗糖等对IgY的热稳定性均有一定保护作用。

    Zuniga等（1997）发现，提纯的蛋黄抗体可在成年猪的胃肠道中被分解，但若将鸡蛋整个地喂食则抗体可保持完整无损。Schmidt等（1989）和Wiedemann等（1990）研究表明，IgY特别是以全蛋形式存在时，能够很好地抵抗被消化过程。

    4IgY吸收和转运

    初乳和常乳中的免疫球蛋白是母源抗体，这些抗体对吮乳仔猪是第一道防线，保护不被环境中的抗原攻击。对剥夺初乳的仔猪口服卵黄抗体是一种人为提供保护性抗体。它们是异源抗体，不是从自然来源获得的抗体，而是从不同的动物品种产生的，可能被动物拒绝。Yokoyama（1993）报道，卵黄抗体在新生仔猪和初乳中抗体一样被有效的吸收和在血液中转运，但卵黄IgY在新生仔猪血液中的半衰期为1．85d，短于猪血清中同源IgG半衰期（12－14d）。这种异源抗体从仔猪血液中迅速的消失，是否是由于对这种外源物质产生代谢作用还没有弄清楚。和初乳抗体一样，在肠道的吸收经过对数的下降后，卵黄抗体的吸收在34h停止。

    IgY若想产生效用，必须能不被胃和肠道酶的降解，结构和功能完整的到达它们的目标区域。Yokoyama（1993）分别在10h和3、6、21、28日龄仔猪通过口腔饲喂5ml浓度为100mg／ml的卵黄免疫球蛋白（抗一K88菌毛抗体，满度4

    800），分别测定饲喂后0、2、6、24h卵黄抗体在胃肠道和血液的分布（结果见表5）。在幼龄仔猪，抗体不被未成熟的胃肠道环境破坏，能稳定的通过胃，并能够通过胃肠道吸收并转运到循环系统。而28日龄仔猪，抗体通过胃肠道丧失大量活性。但另一个试验表明，虽然血清中检测到高含量的抗体，这些仔猪并未能逃脱感染而存活，但如果每天通过口服的形式提供抗体却非常有效，这说明大量抗体转运到血液后对肠道疾病没有作用。

    5IgY在家畜生产中的应用

    5．IIgY在仔猪生产中的应用

    鸡的病原菌对猪、牛等哺乳动物一般无致病性，鸡卵黄免疫球蛋白应用于动物的疾病防治或作为动物的生长促进剂具有广阔的前景。目前，抗轮状病毒、抗大肠杆菌、抗沙门氏菌、抗胆囊收缩素、抗尿素酶等的鸡卵黄免疫球蛋白已有制备。

    表5鸡IgY在猪胃肠道和血液的滴度

    出生后日龄口服IgY后时间(h)抗-K88菌毛抗体滴度

    血清胃十二脂肠空肠回肠大肠

    10h0＜0.1

    12.5±2.5

    44.0±2.0

    56.0＜0.1

    14.3±7.8

    3.3±0.5

    1.0＜0.1

    14.7±5.9

    1.8±0.5

    1.0＜0.1

    19.8±8.2

    1.9±3.5

    1.0＜0.1

    4.5±3.5

    21.5±3.5

    2.0＜0.1

    0.8±0.6

    37.0±7.0

    40.0

    3d

    0

    2

    6

    24＜0.1

    ＜0.1

    ＜0.1

    ＜0.1＜0.1

    28.5±1.5

    1.3±0.3

    0.4＜0.1

    17.5±2.5

    2.2±1.2

    ＜0.1＜0.1

    19.3±0.7

    8.7±1.3

    0.9＜0.1

    16.0±3.0

    20.0

    1.3＜0.1

    1.3±1.3

    19.0±1.0

    32.0

    6d0

    2

    6

    24＜0.1

    ＜0.1

    ＜0.1

    ＜0.1＜0.1

    14.7±0.3

    0.9±0.1

    ＜0.1＜0.1

    32.5±7.5

    1.7±0.6

    ＜0.1＜0.1

    18.5±1.5

    11.3±1.2

    ＜0.1＜0.1

    0.5

    34.5±11.5

    1.9＜0.1

    ＜0.1

    21.5±9.0

    28.0

    21d0

    2

    6

    24＜0.1

    ＜0.1

    ＜0.1

    ＜0.1＜0.1

    14.8±0.2

    1.7±1.2

    ＜0.1＜0.1

    22.3±15.2

    0.1±0.1

    ＜0.2＜0.1

    33.0±13.0

    11.3±1.2

    ＜0.1＜0.1

    0.8±0.6

    6.4±5.7

    1.9＜0.1

    ＜0.1

    4.0±0.8

    3.0

    28d0

    2

    6

    24＜0.1

    ＜0.1

    ＜0.1

    ＜0.1＜0.1

    3.6±0.7

    0.8±0.8

    ＜0.1＜0.1

    2.6±1.3

    ＜0.1

    ＜0.1＜0.1

    18.5±1.5

    11.3±1.2

    ＜0.1＜0.1

    0.4±0.4

    1.9±1.9

    ＜0.1＜0.1

    ＜0.1

    ＜0.1

    ＜0.1

    表6攻毒后IgY预防剂对仔猪的效果

    项目仔猪数攻毒后天数（仔猪存活个数）

    45678101214

    对照1717/1714/1710/178/177/177/177/177/17

    处理1719/1919/1917/1917/1917/1916/1914/1914/19

    Chang－heeKweon等（2000）研究抗流行性腹泻（epidemicdiarrhea）

    IgY对新生仔猪（3d）的预防效果。试验组每天口服IgY2－3ml（32－64SN滴度）。试验组和对照组服用5LD

    50ml的病毒。试验组降低了死亡率（见表6）。在发病猪场的田间试验也提高仔猪的成活率（见表7）。

    表7每窝组口服IgY后的存活率

    猪场存活数/仔猪头数

    处理对照窝数

    A7/85/102

    B8/85/122

    C10/274/275

    总计25/4314/299

    Erhard等（1996）研究特异性IgY对断奶仔猪腹泻的预防效果。含抗大肠杆菌K88、K99、

    987P和抗HRV的特异性Igy鸡蛋粉以饲料形式添加，在仔猪断奶后（28－56日龄）饲喂，添加

    IgY后显著降低腹泻率和死亡率，减轻腹泻程度，减少了抗生素的使用量。Killer等（1994）研究了IgY对腹泻仔猪的治疗作用，用含抗大肠杆菌和抗HRV的特异性鸡蛋粉，在腹泻开始后连续3d（3g／d·头）口服饲喂，仔猪腹泻时间明显缩短。

    Yokoyama（1997）对4周龄断奶仔猪每天一次连续3d口服1011cfuF18+大肠杆菌，从攻毒之日起连续gd饲喂添加抗

    F18+IgY，饲料中添加1∶50滴度抗体的组下痢率较低、增重率较高（见表8、表9）。

    表8不同抗体浓度处理的仔猪攻毒后体增重

    组别仔猪头数饲料混合后抗体滴度②体增重(%)③

    128＜1∶152.4±27.8

    2181∶1052.1±19.1

    3281∶5079.9±31.3①

    注：1．P＜0.01相对于组1；

    2．抗体添加剂1∶100稀释作为样品；

    3．％体增重=(9日龄体重一0日龄体重)×100／0日龄体重。

    表9不同抗体浓度处理的用F18+大肠杆菌仔猪攻毒后的下痢情况

    组别仔猪数在临床观察期仔猪下痢率

    0123456789

    1280324643391111111111

    21801111①2228171711116

    3280214②11①7①00440

    注：1.P＜0.05；

    2.P＜0．01相对于组1。

    5.2IgY预防犊牛腹泻

    犊牛在出生后最初两周最易发生腹泻，主要病原菌是HRV、冠状病毒、K99大肠杆菌和隐孢子等。Yikemori（1993）应用粗制的K99菌毛抗原制成的油乳剂菌毛疫苗，3次强化免疫母鸡，制备高免卵黄抗体，其凝集抗体效价达1∶1024－1∶2048，经初步纯化并喷雾高燥制成卵黄粉，用于犊牛大肠杆菌性腹泻的防治，获得100％的疗效，而对照组100％发病。

    Erhard等（1993）和Ozpinar等（1996）给出生犊牛（0－14日龄）补充抗K99大肠杆菌和HRV的IgY鸡蛋粉，显著降低腹泻率、腹泻程度和腹泻时间（P

    ＜0.05），添加IgY组的日增重显著高于对照组。USP（1996）给18头奶牛分3组进行了10d的试验，A组饲喂含普

    通鸡蛋粉的饲粮，B组饲喂用无乳链球菌和葡萄球菌免疫了的鸡蛋饲粮，C组饲喂含豆粕的饲粮，结果10d后A组与C组的奶中体细胞数较初始提高了25％和28％，B组下降了28％。说明含抗无乳链球菌和葡萄球菌的卵黄免疫球蛋白经口服后，可通过血液循环在非肠道部位发挥作用。Yokoyama（1997）为了保护犊牛在出生后两周内抵抗致死性沙门氏菌的感染，使用抗Styphimurium和Sdublin沙门氏菌的特异性卵黄抗体。在4日龄，犊牛口服1011Styphimurium(试验1)和Sdublin（试验2）沙门氏菌，从攻毒之日起，每天口服3次卵黄抗体溶液7到10d。在试验1用Styphimurium的试验表明：组2和组3分别为100％和33％的死亡率，而组4有100％的成活率（见表10）。说明犊牛的成活率和使用的抗体剂量成正比。下痢和发烧的严重程度在成活的犊牛中随抗体浓度增加而下降。处理4的分离率和大肠杆菌计数比较低（表11）。在试验

    2用Sdublin的类似的结果。

    表10犊牛用Styphimurium和Sdublin沙门氏菌攻毒后并不用滴度的抗体溶液处理后的临床反应

    组别抗体

    滴度犊牛下痢数/总数下痢

    ONSET发烧ONSET（超过40）存活阶段第7d存

    活率（%）

    1d3d5d7d

    1＜103/6(1.5)②5/5(2.6)2/2(3.0)0/01.8±0.61.0±0.63.8±1.10

    22505/6(2.3)4/4(3.0)2/2(3.0)0/01.2±0.41.3±0.53.6±1.50

    35000/6(0.2)4/6(2.0)3/4(2.3)2/4(1.5)3.2±1.11.2±1.15.8±1.7①57

    410000/6(0)4/6(1.8)4/6(2.0)4/6(2.0)3.5±1.32.2±0.97.0±0.0100

    注：1.P＜0.05,tP＜0.01，相对于1组（对照）；

    2．在临床观察的粪便评分。

    表11攻毒犊牛的直肠拭样和器官样品中Styphimurium分离率个滴度

    组别抗体滴度直肠拭样样品阴性数/总数肠道器官和直肠拭样阴性数/总数

    1d3d5d7d十二指肠结肠盲肠直肠肝脏肾脏肺

    1＜106/6(7.5)①5/5(7.7)2/2(8.1)0/0死亡4/6（4.3）5/6(5.6)6/6(7.4)6/6(8.0)6/66/66/6

    22506/6(6.6)4/4(7.3)2/2(7.7)0/0死亡4/6(3.8)6/6(6.4)6/6(7.0)6/6(7.3)6/66/66/6

    35006/6(6.7)6/6(6.8)3/4(4.4)2/4(3.0)死亡2/2(5.5)2/2(7.7)2/2(7.7)2/2(7.1)2/22/22/2

    死亡1/4(1.9)3/4(2.7)3/4(3.0)3/4(4.0)2/42/42/4

    410006/6(6.9)4/6(4.1)②4/6(3.8)3/6(3.0)死亡2/6(1.3)2/6(1.6)②2/6(1.6)②4/6(2.9)1/61/61/6

    6IgY的应用前景

    经特定抗原的免疫，可从鸡蛋中获得大量的抗特异性病原的免疫球蛋白，口服鸡卵黄免疫球蛋白可有效预防和治疗细菌和病毒引起的消化道和非消化道疾病，提高动物特别是幼龄动物的生产性能，减少死亡率。鸡卵黄免疫球蛋白性能稳定，是一种新型、高效的绿色饲料添加剂，具有广阔的应用前景。