新一代的饲用酶制剂--细菌性木聚糖酶

     阿拉伯木聚糖（Arabinoxylan，AX）是广泛存在于常用植物性饲料原料（玉米、小麦、莱粕和棉粕）中的非淀粉多糖（Non－starch polysaccharides，NSP），是限制营养物质有效利用的主要抗营养因子。AX通常根据溶解性分为水溶性阿拉伯木聚糖（Water一extractable Arabinoxylan，WEAX，约占总AX的25％～30％）和不溶性阿拉伯本聚糖（Water-unextractable Arabinoxylan，WUAX，约占总AX的70％～75％）。大量研究证实可溶性AX可增加小肠内容物粘度，从而阻碍营养物质与消化酶结合及营养物质在小肠粘膜上的消化吸收（Danicke等，1995），而且粘度的增加会抑制内源消化酶的活性（Almiral，1995），降低食靡的通过速度，降低动物采食量，增加胃肠代谢和内源损失（Low等，1989；Silah等，1991；Belford，1996）；此外，植物原料中不溶性AX包裹淀粉、蛋白质等营养物质，阻止营养物质与消化酶的接触，降低营养物质的消化率（Mulderd等，1991）。因此，消除阿拉伯木聚糖的杭营养作用对进一步提高饲料资源利用率。拓宽饲料资源和提高养殖经济效益具有重要意义。

    木聚糖酶以其可有效降解阿拉伯木聚糖，消除阿拉伯木聚糖对动物的抗营养作用，已成为一种在养殖业中广泛应用的酶制剂。以往主要采用真菌性木聚糖酶，近年来，细菌性水聚糖酶以其稳定性好，酶解效率高等特点引起了业界的广泛关注。以下就细菌性水聚糖酶的结构特征、生化特性、作用特点及其在饲料中的应用作一简要探讨，为细菌性本聚糖酶的应用提供理论参考。

    1细菌性木聚糖酶的生化特征

    1.l酶源菌株

    生命活动的过程就是酶促反应，而酶的耐温性能往往与酶源菌株生活的适宜温度相关。目前，水聚糖酶主要来源于细菌和真菌。大多细菌属于体温型微生物，适宜生长温度在35～40℃左右，比一般真菌（20～25℃）为高，所以在细菌中更易于筛选出耐热性能好的产酶菌株。并且，细菌属于原核微生物，其细胞结构及基因重组简单，易于利用基因工程及诱变育种筛选出高产菌株。

    1.2结构特征

    在分子水平上，木聚糖酶由功能或非功能结构域和连接区组成，功能结构域又可进一步分为催化结构域和纤维素结合结构域（cellulose binding domain，CBD）（Gilk，S等，1991）。木聚糖酶的催化结构域决定酶的水解特性，并作为该酶分类的基础。木聚糖酶的氨基酸组成在数量上变化很大，但其催化结构域趋向一致。CBD存在于许多木聚塔酶分子中，它在功能和氨基酸组成上与纤维素酶分子中的CBD相似：①在靠近N末端和c末端分别有一个半胱氨酸；②除甘氨酸、天冬氨酸之外，还含有4个高度保守的色氨酸残基；③带电荷氨基酸的含量较少（刘瑞田等，1998）。非功能结构域主要是连接序列。连接区连接在催化结构域和CBD之间，并赋予了蛋白质结构的柔韧性。此序列的长度变化很大为6～59个氨基酸。该序列中或含有较多的脯氨酸，或带羟基的氨基酸，或两者都有。这些氨基酸被广泛的O-糖基化。根据酶的来源不同，连接区的序列长度和它们所含有的脯氨酸和带羟基的氨基酸数量都不同（胡沂淮等，2002）。

    以氨基酸序列相似性和疏水性的聚合分析为基础， Henrissat和 Bairoch（1993， 1996）将糖基糖苷键水解酶中的内切木聚糖酶分为10族和11族。这相当于Gilkes（1991）等分类的第F家族和第G家族。它们分别组成高分子量和低分子量的木聚糖酶。10族内切木聚糖酶主要包括酸性和大分子的内切葡聚糖酶，而碱性的和小分子的内切木聚糖酶则属于11族。

    l.3生化特性

    细菌和真菌来源的木聚糖酶只含一个亚基（Sunna等，1997），对于木同生物来源的木聚糖酶，分子量范围为8～145kD，pH范围为3～10.5，稳定pH范围为3～10。大多数酶的反应最适pH范围为4～7，最适温度为40～60℃。

    根据酶的理化特性，可分为两大类，即分子量小于30kD的酶和分子量大于30kD的酶，前者通常为碱性蛋白，后者通常为酸性蛋白（Wood等，1988）。通常细菌可产生两种木聚糖酶，即低分子量的碱性水聚糖酶和高分子量的酸性水聚糖酶，但真菌通常只产生低分子量的碱性水聚糖酶。

    2 酶学特性

    很多学者对内切木聚糖酶的酶解作用模式进行了广泛的研究（Coughlan，1992； Coughlan和Hazle-wood，1993；Biely，1997）。通常，木聚糖酶对多聚木聚糖的内部β一1，4键有活性，这种木聚精酶称为内切木聚糖酶。根据其对不同多糖的活性，内切木聚糖额又可分为特异性和非特异性木聚糖酶（Coushlan，1992；Coughlan等，1993）。特异性内切木聚糖酶仅对木聚糖的β－l，4键有活性，而非特异性内切木聚糖酶可以水解以β－l，4键连接的木聚糖、混合木聚糖的β－l，4键及其它β－l，4连接的其它多糖。大多数内切木聚糖能特异性地作用于木聚糖的非取代木塘苷键，并释放取代的和非取代的木寡糖，而其它内切木聚糖酶特异性作用于主链上的接近取代基团的木糖苷键。通过对10和11族内切木聚糖酶作用模式的研究，得出：①10族内切木聚糖酶与11族的内切木聚精酶相比，10族内切木聚糖酶水解异型聚糖（取代木聚糖）和同型木聚糖的能力更强；②只有10族内切木聚糖酶才能裂解水聚糖的相邻或邻近取代基（如甲基葡糖醒酸和乙酸）之间的糖苷键；③与11族相比，10族内切木聚糖酶比水解葡糖醛木聚糖、乙酸木糖释放出的寡糖分子量更小（ Biely等，1997）。另外，据报道10族内切木聚糖酶发挥作用在2个支链接点上需要2个不可取代的木糖残基；而11族内切木聚糖酶在相同的序列发挥作用需要至少3个不可取代残基（Biely等，1997）。

    因此，内切水聚糖（l1族）仅能裂解谷物的阿拉伯木聚糖的内β－l，4键时，而内切木聚糖酶（l族）可裂解如同内β－l，4键一样的相邻阿拉伯木聚糖取代基。因此对木糖和葡萄糖残基中的β－l，4键的裂解能力，是10族和11族内切葡聚糖酶之间的主要不同点。基于此点，Biely（1997）推断：如果存在β－l，4葡聚糖，那么10族内切木聚糖酶可裂解β－ l，4吡喃葡糖苷键，但11族的葡聚糖的可能性很小。一般来说，有效而彻底的分解木聚糖需要有不同特性的主链裂解酶和支链裂解酶的协同作用（Coughla等，1993；Coughlan和Hazlewood，1993）。

    3细菌性木聚糖酶作为饲用酶的特点

    3.1热稳定性及贮存稳定性

    稳定性对酶制剂特别是饲用酶制剂至关重要，是影响酶制剂使用效果的关键因素。目前，从嗜热性微生物如细菌，真菌和放线菌中均发现了许多木聚糖酶，它们具有很高的热稳定性，但是真菌来源的木聚糖酶的热稳定性没有细菌来源的木聚糖酶高。在嗜热性细菌中，属于第10家族的木聚糖酶中普遍含有增加热稳定性的结构域，它们与木聚糖酶的催化结构域紧密连接在一起。对不同来源的热稳定结构域的序列分析，发现它们具有5％～32％的同源性，其中有保守的 G1y和 Tyr残基，无 Cys残基。在热稳定结构域中，大的疏水性的芳香族氨基酸占优势，它通过增加折叠分子的紧密性来增加热稳定性，而Asp和Glu残基相对很少，因为它们在高温下更容易变性，导致热失活（胡沂淮等，2002）。在第11家族除嗜热单胞菌（Theermomonosora fusca）的嗜热木聚糖酶 A外，没有热稳定的非催化结构域，这可能是由于这些酶在本质上更耐热，而不像第10家族的木聚糖酶通过折叠而使它们相对容易进化为嗜热性酶（fontes等，1995）。

    Bedford和Schulze（1998）的综述表明，木聚糖酶的稳定性与其结构是休戚相关的。细菌性木聚糖酶大都来源于嗜热性细菌，属于第10家族的木聚糖酶中由于普遍含有增加热稳定性的结构域，因而在热稳定性上要好于来自真菌的，属于第11家族的木聚糖酶。Himmelstein（1985）比较了一种细菌性木聚糖酶和一种真菌性水聚糖酶的热稳定性，结果表明在80℃的造粒温度下，细菌性木聚糖酶的活性保留值为80％；而真菌性水聚糖酶仅保留5％左右（见图1）。

    3．2 较高的内切木聚糖酶比例，酶解效率高

    细菌性木聚糖酶主要由内切性木聚糖酶组成，分解木聚糖的效率高。细菌性水聚糖酶大多属于10族内切酶，与11族的内切木聚糖酶相比，10族内切木聚糖酶水解异型聚糖（取代木聚糖）和同型木聚糖的能力更强，而且只有10族内切木聚糖酶才能裂解水聚糖的相邻或邻近取代基（如甲基葡糖酸酸和乙酸）之间的糖苷键。此外，10族内切木聚糖酶水解葡糖醛木聚糖、乙酰木糖释放出的寡糖分子量较11族更小（Biely等，1997）。因此大多属于10族的细菌性木聚糖酶的酶解效率要高于属于11族的真菌性木聚糖酶。Ingelbrecht等（2000）比较了分别来自枯草杆菌、曲霉菌和木霉菌的3种木聚糖酶的水解效率，结果表明来自枯草杆菌的细菌性水聚糖酶的水解效率最高，能高效降解底物。此外，与真菌通常只产生低分子量的碱性木聚糖酶不同，细菌一般即可产生低分子量的碱性木聚糖酶，也可产生高分子量的酸性木聚糖酶。因此，细菌性水聚糖酶相对具有更广的活性pH值范围，可更加有效地在不同动物的胃肠道中发挥作用。

    3.3彻底降解木聚糖

    不但可作用于可溶性木聚精（WEAX），而且可作用于不溶性水聚糖（WUAX），进一步释放细胞壁中包裹的营养物质。在各种植物原料中都存在不溶性AX，它们和纤维素相互作用包裹营养物质形成营养屏障，影响营养物质的吸收。部分谷物原料中 WEAX与WUAX的含量如表1。

表l  一些谷类中的阿拉伯木聚精的含量（％干物质）

项目	小麦	麦麸	大麦	裸麦	黑小麦	高梁	玉米	大米	米糠	次数
WEAX	1.8	1.1	0.8	3.4	1.3	0.1	0.1	T	0.2	1.3
WUAX	6.3	20.8	7.1	5.5	9.5	2.0	5.1	0.2	8.3	23.8

 

    所以细菌性木聚糖酶不但可应用于小麦型日粮，而且可广泛应用于豆粕、玉米、饼粕等植物原料为主的饲料中。

    3.4 对酶活抑制剂不敏感

    酶的本质是蛋白质，从理论上讲会受到内源性蛋白酶及其它酶抑制剂的影响。但国外相关研究报道，细菌木聚糖酶对于它们都不太敏感，当与这些抑制剂接触后，仍保留较高活性。

    3.5 pH适应范围广

    细菌性水聚糖酶pH适应范围广，在中性pH（6.5左右）呈现最高的活性，在胃部末达到最高值，但其稳定性很好，进入肠道后酶被进一步激活并呈现更高的酶活，使食糜在动物肠道内更好地被降解消化吸收。

    随着我国养殖规模化的发展，充分利用非常规饲料资源，解决我国饲料资源匾乏和进一步提高养殖经济效益已成为我国畜牧业长期、持续和健康发展的关键。细菌木聚糖酶作为新一代酶制剂以其良好的热稳定性和酶解效率等特点必将在饲料及养殖业中得到广泛的应用，对细菌木聚糖酶进行理论和应用方面的研究是很有意义的。