纵述：疯牛病与转基因动物研究

    随着分子生物学和分子遗传学的飞速发展, 人们对动物疫病的控制和预防越来越倾向于转基因技术。近年来, 疯牛病在欧洲和美国的暴发与蔓延, 它是宿主自体朊蛋白的一种构象病, 不能进行免疫识别, 而对该病的发病机理的研究仍待深入, 目前人们对该病的预防仅限于防, 而不能治, 因此, 转基因动物的培育, 将会给此类疫病的防治带来福音。

    在进行动物传染病防治时, 我们采用多种方法,包括免疫接种、卫生管理和科学治疗等, 尽管许多科学方法对疾病的控制起到了一定作用,如动物试验、分子生物学研究和基础病理研究等, 但是许多传染病还是困扰着我们, 然而对于传染病的控制最好的途径就是选育良好的具有抗病能力的动物来阻止疾病的发生。这就涉及到转基因动物的研究,需要人们进行深入的研究。

    疯牛病一直是困扰人类的一种烈性传染病, 由朊病毒蛋白( Prion Protein , PrP) 引起的以潜伏期长、精神失常、共济失调、后肢瘫痪和狂暴不安的神经症状为特征的危害人类的传染病。近期研究发现朊蛋白结构变化, 由α螺旋转化为β 折叠而引发疯牛病, 而且人的克雅氏综合症、绵羊痒病等都是由朊病毒蛋白有关的疾病, 是动物传染性海绵样脑病( TSE) 中的一种,BSE首先于1986 年在英国发现, 随后波及欧洲许多国家和地区, 给英国和欧洲的养牛业造成了巨大损失。

    近几年因BSE 的流行, 随着由同一致病因子PrP 引起人的变异型克雅氏症(vCJD) 的出现, 导致了全世界对疯牛病的恐慌, 它引起了大量的经济损失和危害人类健康, 越来越受到人类的关注。

    从疯牛病的发生与发展来看,人类需要加大科学研究力度, 作好预防工作, 正因为疯牛病目前还不可治, 所以在最有效的措施应该作好品种选育工作, 如果进行转基因选育出具有抗PrPSC 构型转变基因的牛, 将会在很大程度上阻止疯牛病的发生, 目前在日本已经有过此类转基因牛的选育,获得了成功,从而提高了动物的抗病力, 为人类控制疾病带来福音。

    1 疯牛病的转基因研究

    许多科学家在对疯牛病的病因研究时, 采用转基因老鼠, 进行PrP基因结构分析, 并利用转基因鼠研制出了抗PrP 的单克隆抗体, 在临床上进行试验取得有效成果。使人类对疯牛病在分子水平上有了科学评价和诊断依据。但是目前还没有有效的疫苗、药物能够根除疯牛病,对此病的防治仍然重在防, 既然对疯牛病的病因有了明确的定位, 那么,我们只要提取上其他动物抗PrP基因进行牛的转基因选育, 得到转基因牛, 将会更好地防止疯牛病的发生, 这就需要大量的转基因研究。日本在此方面已经走在了前面,应该在全球进行推广。

    2 转基因动物研究进展

    转基因动物研究是人类按着自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成, 是基于现代分子生物学和动物胚胎和配子生物工程技术的一项实验技术。毫无疑问,这是一项极富挑战性的研究。

    2. 1 转基因动物的研究历程

    1982 年, 英国Nature 上发表Brinster 和Palmiter 利用转基因技术得到含有外源GH基因的超级小白鼠的消息,引起全世界轰动。这是外源基因首次在动物体内得到表达。1985 年, 美国人用转移GH 基因、GRF 基因和IGF1 基因的方法, 生产出转基因兔、转基因羊和转基因猪;同年德国Berm 转入人的GH 基因生产出转基因兔和转基因猪; 1987年,澳大利亚转移羊利用注射牛GH基因的方法生产出转基因猪。由于病理反应, 此阶段并未培育出有价值的转基因动物。1987 年, 美国的Gordon 等人首次报道在小鼠的乳腺组织中表达了人的tPA 基因。在此后的4 年中, 陆续有数种有商业开发价值的产品在动物乳腺中生产出来。1991 年英国人在绵羊乳腺中表达了人的抗胰蛋白酶基因; 1992 年美国的Velander 又报道在猪的乳腺中表达了人的C蛋白基因。此后,由于商业目的,公开报道减少,但生物反应器方面的研究一直在进行, 有人还研究利用膀胱作为生物反应器。除上述生物反应器的应用研究之外, 在动物育种方面也取得了较大进展。由于国家大力支持,我国在转基因动物研究方面也取得了较大的进展。利用转移羊的MT/ 猪GH融合基因的方法, 获得了快速生长的转基因猪; 1990 年获得快速生长的转基因兔; 1991 年获得快速生长的转基因羊。

    2. 2 转基因动物的制作方法

    2. 2. 1 原核期胚胎的显微注射

    该方法由美国人Gordon 发明,是目前应用比较广泛、效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。这一方法是将外源基因注射到受精卵中, 然后由经过转基因操作的受精卵发育成新的动物个体。此方法操作简单,转基因速度快,对外源基因片段的大小要求不严, 产生嵌合体的比例较小。对转基因动物进行分子生物学的分析, 可以获得更多的有关基因表达的信息及基因调控的知识。Gordon 将SV40 的复制原点和启动子与疱疹病毒的TK基因插入细菌质粒pBR322 , 然后将其注入受精小鼠的原核, 并将经质粒注射后的胚胎植入假孕母鼠的输卵管。之后对出生的小鼠用Southern 印迹杂交法检测其基因组中是否含有注射基因的同源片段。在出生的78 只小鼠中,其中两只被认为是转基因阳性。由于条件的限制, Gordon 当时并未得到活的转基因小鼠, 但这一伟大的尝试确证了外源基因可以通过这种方法整合到宿主基因组中, 从而为以后的研究工作开辟了一条崭新的途径。继Gordon 报道了显微注射法产生转基因小鼠之后,Palmiter1982 年的报道在生命科学领域中引起了一场不小的轰动。

    Palmiter 将5’ 端调控区缺失后的大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白I 基因启动子相连接, 然后将融合基因注入受精小鼠的雄原核, 生出21 只小鼠,其中7 只为转基因阳性鼠。在阳性鼠中,2 号鼠在出生后74 天时, 体重达到同窝非转基因小鼠平均体重的1. 87 倍,这便是著名的“巨型小鼠”事件。Hammer 等利用该方法成功地制作了转基因兔、绵羊和猪。上述三起研究被认为是动物转基因研究历程上的里程碑。

    2. 2. 2 逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎

    此项技术是利用逆转录病毒在感染寄主时可以将病毒的一部分DNA 整合到宿主细胞的特点, 通过这一作用, 人们可以将体外构建的基因重组到病毒载体上, 再用带有目的基因的病毒感染动物细胞, 以达到将病毒携带的目的基因转入动物细胞的目的。此项技术早在1974年就有报道。利用逆转录病毒载体技术进行转基因时, 一般是采用动物的早期胚胎细胞进行。将它们与病毒共培养, 然后将感染病毒的细胞转移到适当的母体完成发育过程, 获得转基因动物。逆转录病毒载体技术用于动物转基因的优点,是可以进行多细胞胚的转化, 在鸡的转化研究中使用得尤其较多。它的缺点是获得纯合体的转基因动物的机会少,病毒载体构建复杂,转入的外源基因的大小受到限制, 还有可能在转基因的同时带入病毒载体序列,这是我们所不需要的。

    2. 2. 3 精子载体法

    早在1971 年Bracket 及其合作者就开始了精子介导外源DNA 转移的先驱工作: 将精子暴露于纯化的SV40 DNA(H3 标记腺嘌呤) 中后, 在精子头部检测到放射性物质。他们的结果表明异源DNA 可以进入哺乳动物精子, 而且精子能将外源DNA 携入卵母细胞。Rottman等对精子载体法进行了改进, 其改进方法是将外源DNA 在与精子共同孵育之前用脂质体包埋, 脂质体与DNA 相互作用形成脂质体DNA复合体。这种复合体比较容易和精子细胞膜融合, 从而进入细胞内部。这种改进以后的精子载体法在转基因鸡的制作上获得了满意的结果。对12 日龄鸡胚用Southern 印迹杂交法检测发现转基因阳性率为26 % , 最理想的一次阳性率高达92 %。实验还显示外源DNA 并未整合进宿主基因组, 而是以附加体的形式存在于染色体之外。

    2. 2. 4 胚胎干细胞技术

    胚胎干细胞( ES) 是早期胚胎经体外分化抑制培养建立的多能性细胞系,体外培养时保持末分化状态,可以传代增殖。ES 细胞在发育上类似于早期胚胎的内细胞团细胞,当被注入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。ES 细胞具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点,是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。在转基因领域, ES 细胞是公认的研究基因转移、基因定位整合的一类极有前途的实验材料。

    2. 2. 5 原生殖细胞技术

    原生殖细胞( Primordial Germ Cells , PGCs) 介导的转基因技术在原理和方法上与ES 细胞技术相似, 应用PGCs 技术在制作转基因家禽方面有明显的优势。Brinster等尝试了在公畜个体之间转移精原细胞的可行性, 研究者将ZFlacZ系供体小鼠的PGCs 植入C57BL/6 ×STL 杂交一代小鼠的曲精细管, 之后的研究结果表明经移植后的PGCs 能够发育成具有受精能力的精子细胞, 并产生了后代。Naito等应用此方法制作了转基因鸡。大家畜PGCs 可否象小鼠ES 细胞那样抑制分化并增殖, 到目前还不能得出确切结论。如果能, 这将为动物转基因带来一场革命。已有研究证实PGCs 具有受精能力。这项技术结合基因定位整合技术极有可能在较短的时间内得到转基因家畜纯品系。

    2. 3 转基因动物研究的应用

    2. 3. 1 促进动物生长、提高畜产品产量、改善产品品质

    继Palmiter将大鼠的GH基因导入小鼠基因组得到巨型小鼠之后,牛、绵羊及人的GH基因也先后导入小鼠基因组, 得到的转基因小鼠在快速生长期(5～11 周龄) 生长速度达到对照组小鼠的4 倍。外源GH调节生长的机理被认为是可以刺激宿主动物胰岛素样生长因子的合成与分泌。人类在转bGH基因猪方面的部分研究结果表明, 转基因猪日增重增加, 饲料转化率提高。

    用转基因公羊与43 只母羊交配,生出85 只羔羊, 其中43 只(50. 6 %)为转基因阳性。羔羊在14 月龄剪毛时, 转基因羊净毛平均产量比其半同胞非转基因羊提高了62 % , 公羔羊产毛量提高的幅度(92 %) 高于母羔羊(34 %) 。在毛纤维直径、髓质以及周岁体重方面无显著差别。此外, Powell 等将毛角蛋白Ⅱ型中间细丝基因导入绵羊基因组, 转基因羊毛光泽亮丽, 羊毛中羊毛脂的含量得到明显的提高。

    2. 3. 2 利用转基因动物作为生物反应器

    2002 年4 月1 日, 美国乔治亚大学和AviGenics 公司4 月1 日在英国《自然生物技术》杂志4 月刊上撰文宣布, 他们在家禽转基因研究领域获得突破性进展, 已培育出能产下含人体所需蛋白质的转基因鸡蛋的克隆鸡。它将加盟能生产药用蛋白质转基因动物如绵羊、山羊和兔子等的行列, 有望成为一种新型活体生物反应合成器和动物制药工厂。利用转基因动物生产目的基因产物是转基因动物应用的又一重要领域。将外源基因转入动物, 获得转基因动物, 从动物的乳汁或血液中获得目的产物, 代替传统上用的发酵罐。通过基因工程技术可以不断的提高转基因动物基因表达水平, 从而使基因产物的产量获得不断提高, 用转基因动物生产来代替发酵罐,成本将大大降低,获得可观的经济效益和社会效益。

    2. 3. 3 动物品种改良

    很明显, 将有利目的基因转入受体动物, 将为家畜品种的改良提供一条非常有效的育种新途径。它可以不受传统育种方法只限于可以相互杂交的家畜品种间的有利基因的利用。科学工作者已经通过转基因的途径获得了转基因的鱼、鸡和猪等有经济价值的材料。我国学者朱作岩用显微注射技术获得了比对照组生长快两倍的转基因金鱼, 及生长速度明显加快的转激素基因鲫鱼、红鲫鱼、银鲫鱼、镜鲤鱼及泥鳅鱼。目前转基因鸡是用逆转录病毒作为载体的转化技术获得的。流感病毒可感染多数禽类及哺乳动物,而小鼠可以有选择性地抗流感病毒的侵染, 研究表明这种抗性与其Mx基因的表达有关。Garber 等将克隆的小鼠Mx 基因的有义链和反义链插入处于复制感受态的禽反转录病毒载体中, 并以之转染鸡胚胎成纤维细胞(CEF) 。结果表明,只有经插入有义链的反转录病毒载体转染的CEF 才能产生Mx 蛋白,同时表明经插有义链反转录病毒载体转染的CEF 对人流感病毒、禽流感病毒的感染具有抵抗作用, 而对包被的RNA 病毒、疱疹性口炎病毒(VSV)无抵抗作用。而抗PrPSC 基因的转基因牛的选育成功给疯牛病的防治带来了新的途径。

    2. 3. 4 建立诊断和治疗人类疾病的动物模型

    科学工作者将致癌基因转入小鼠受精卵, 获得了带有致癌基因的小鼠。这些小鼠为研究癌症基因的致病机理及癌症基因表达的调控过程、新药物治疗效果的试验,提供了理想的动物模型。类似的动物模型可以用来研究很多与遗传有关的疾病,如血液病。转基因模型动物也是研究基因治疗的良好材料, 如发展针对某种疾病的治疗方案、药物的试验等。人类在认识诸如AIDS 这样疾病的病理形成上进展极为缓慢,原因在于没有合适的小动物模型用以研究HIV1 对宿主细胞的感染以及随后的发展过程, 因此也难以制定有效的诊断、治疗、预防措施。动物转基因技术的应用为解决这类研究所需的动物模型提供了极大的方便。Snyder 等将人CD4 融合基因导入家兔基因组, 成功地制作了可用于研究HIV1 感染宿主细胞的动物模型。HIV1 可以感染普通家兔, 由此推测转hCD4 兔对HIV1 更易感。

    这些模型的建立无疑会加速人类对AIDS 的认识, 并采取适当的措施预防和治疗疾病。

    2. 3. 5 生产可用于人体器官移植的动物器官

    异源器官移植可能是解决世界范围内普遍存在的器官短缺的有效途径。目前对器官供体动物研究较多的是猪。猪作为人类器官移植的供体动物有以下一些优势: 妊娠期短, 产仔数多, 后代生长快, 而且不存在伦理学方面的问题。更重要的是猪的不同发育时期的器官, 诸如心、肾等与不同年龄的人的器官在大小上比较接近, 极有可能代替病人的某些器官。

    3 展望

    转基因动物研究在其问世后的十多年里,经过世界各国献身于该领域的科学家们的不懈努力,其辉煌前景初露端倪。将其应用于疯牛病的转基因防治研究还在起步阶段,该项技术目前的研究水平与其产生巨大的社会及经济效益之间仍存在相当的距离,所以真正应该在疾病的防治与科学的研究连接,借助于转基因动物研究,使人类早日摆脱疯牛病等人畜共患病的困扰,相信这项研究的前景是辉煌的。