猪肝中克伦特罗检测方法—酶联免疫吸附测定法
1 范围
本标准规定了猪肝中克伦特罗检验的制样和酶联免疫吸附测定方法。
本标准适用于猪肝中克伦特罗的残留常规快速筛选及定量检测。
2 测定方法
2.1 原理与方法
测定的基础是抗原抗体反应。酶联板包被有克伦特罗特异性抗体的抗体，加入抗克伦特罗的特异性抗体，两者结合被固定。标样或试样中克伦特罗与酶（辣根过氧化物酶）标记抗原竞争抗克伦特罗的特异性抗体。通过洗涤以除去没有与抗克伦特罗的特异性抗体结合的酶标记抗原。加入酶基质（过氧化尿素）的发色剂（四甲基联苯胺）结合到酶联板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝色转变为黄色。在450nm处测定吸光度值。吸光度值与样品中的克伦特罗浓度成反比。
2.2 试剂、用途及仪器、设备
需自备的试剂、设备：
2.2.1 50mmol/L盐酸
2.2.2 1 mol/L氢氧化钠
2.2.3 50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液PH3.0
2.2.4 500 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液PH3.0
2.2.5 甲醇：分析纯
2.2.6 分析天平
2.2.7 匀浆机
2.2.8 固相萃取装置
2.2.9 微孔板酶标仪（450nm）
2.2.10 离心机
2.2.11 微型振荡器
2.2.12 微量加样器（20μl，50μl，100μl，200μl，250μl）
2.2.13 C18柱
竞争酶标免疫法试剂盒可用于定量测定尿、肌肉、肝脏等中的克伦特罗。试剂盒中包括了预处理完成后检测用的试剂：
2.2.14 克伦物罗系列标准溶液（0ng/L，100ng/L，，300ng/L，900ng/L，2700ng/L，8100ng/L）
2.2.15 酶标板
2.2.16 抗克伦特罗的特异性抗体
2.2.17 酶标记抗原
2.2.18 缓冲溶液
2.2.19 酶基质/发色剂
2.2.20 反应停止液（1mol/L硫酸）
3 制样
3.1 样品的制备
3.1.1 将猪肝样品解冻，剪碎置于匀浆机中高速捣碎，取5g匀浆的猪肝样品与25ml l50mmol/L盐酸混合，振荡1.5h均质。
3.1.2 称6g 均质物（相当于1g肝脏），加入离心瓶中，在10℃-15℃，至少4000g离心15min。
3.1.3 转移上清液到另一个离心瓶中，加300μl
1mol/LNaOH[3.2.2]混合15min，加入4ml500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液PH3.0[3.2.4]，简单地混合，并在4℃保存至少1.5h或过夜。
3.1.4
再在10℃—15℃，至少4000g离心15min，分离全部上清液（应该是清亮的，非常重要），使其升至室温（20℃—24℃），然后用C18柱纯化。
3.2 C18柱纯化步骤
所有试剂和样品提取液在过柱纯化前应达到室温（20℃-24℃），纯化过程中严格控制过柱时的流速。
3.2.1 用3ml甲醇[3.2.5]洗涤柱子，流速为每秒1滴。
3.2.2 用2ml洗涤液[3.2.3]洗涤柱子
3.2.3 样品进柱（分离的全部上清液）
3.2.4 用2ml洗涤液[3.2.3]洗涤柱子。
3.2.5 用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹2min干燥柱子。
3.2.6 用1ml甲醇[3.2.5]洗脱样品，流速为每分钟15滴。
3.2.7 50℃-60℃下用弱空气或氮气流将洗脱液完全蒸干。
3.2.8 用1ml双蒸水溶解干燥的残留物，取20μl进行分析。
3.3 样品的保存
3.3.1 未处理的样品冷冻保存。
3.3.2 盐酸均质后的样品2℃—8℃可保存3天。
3.3.3 以磷酸二氢钾缓冲液提取后的样品（C18柱纯化之前）2℃—8℃可保存2天，使用前离心。
3.3.4 C18柱纯化步骤（即4.2.6）所获得的甲醇洗脱物冷冻可以保存数周，2℃—8℃可保存2周。
3.3.5 用双蒸水溶解的干燥残留物(即4.2.8)2℃-8℃可保存1周。
3.4 测定
测定之前将所有试剂回升至室温20℃-24℃，供试样品取其上清液。
3.4.1 测定程序（室温20℃-24℃条件下操作）
（1）将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。
（2）加入100μl稀释后的抗体溶液到每一个微孔中底部，在室温孵育15min。
（3）倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每行拍打3次）以保证完全除去孔中的液体，用250μl蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，重复操作两遍以上。
（４）精密吸取２０μl标准溶液［3.2.14］及处理好的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行实验。
（5）加入100μl稀释的酶标记物到微孔底部，在微型震荡器上混匀，室温孵育30min。
（6）重复步骤（3）
（7）加入100μl基质/发色试到微孔中，在微量振荡器上充分混匀（或小心地在平面上转动酶标板以充分混合），并在室温暗处孵育15min。
（8）加入100μl反应停止液到微孔中，混匀。在60min内450nm处以空气为空白测定吸光度值。
3.4.2 结果判定和表述
按下式计算百分吸光度值：
百分吸光度值=B/B0×100%
式中：B—为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；
B0—为零标准的标准溶液平均吸光度值；
以X轴为标准溶液中克伦特罗浓度（ng/L）的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。从标准曲线上查出供试样品中克伦特罗的浓度（ng/L）。也可以用专业计算机软件求出供试样品中克伦特罗的浓度。
检测结果小于1000ng/kg时判为未检出，大于或等于1000ng/kg时判为可疑，需要复检后再确定。复检后小于或等于1000ng/kg为未检出，大于1000ng/kg为阳性。猪肝稀释系数为1。
江西省地方标准
DB36/T410-2003
猪尿中克伦特罗检测方法—酶联免疫吸附测定法
前言
克伦特罗为β—肾上腺素受体激动药，是一种用于人治疗哮喘、支气管痉挛的药物。研究发现在饲料中添加克伦特罗可促进动物生长、提高瘦肉率，特别是改进脂肪型动物的肉与脂肪的比例，猪饲用后生长速度快，体型好，且瘦肉多、脂肪少，被当作“瘦肉精”而成为一些饲料生产企业和养猪户的“秘密武器”。但是克伦特罗进入猪体内后，主要分布在肝等内脏器官，在体内代谢的时间较长，容易造成药物在组织中残留，给消费者带来危害；健康的人在食用一定量的残留有克伦特罗的猪肉或内脏后，可能出现肌肉震颤、心慌、战栗、恶心、代谢紊乱、呼吸急促、烦躁不安等症状。由于克伦特罗的性质稳定，能够在猪尿中以原形排出，因此制订猪尿中克伦特罗的检测方法，以监测“瘦肉精”的使用，显得非常重要。
竞争酶标免疫法是非常有效的筛选方法，可定量测定尿、肌肉、肝脏及牛眼中的克伦特罗。此法快速简便、经济实用，较易掌握推广。
本标准由江西省农业厅提出。
本标准由江西省兽药饲料监察所负责起草。
本标准起草人：刘安南、陈文云、万文根、徐国茂。
猪尿中克伦特罗检测方法—酶联免疫吸附测定法
1 范围
本标准规定了猪尿中克伦特罗检验的制样和酶联免疫吸附测定方法。
本标准适用于猪尿中克伦特罗的残留常规快速筛选及定量检测。
2 测定方法
2.1 原理与方法
测定的基础是抗原抗体反应。酶联板包被有克伦特罗特异性抗体的抗体，加入抗克伦特罗的特异性抗体，两者结合被固定。标样或试样中克伦特罗与酶（辣根过氧化酶）标记抗原竞争抗克伦特罗的特异性抗体。通过洗涤以除去没有与抗克伦特罗的特异性抗体结合的酶标记抗原。加入酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）结合到酶联板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝色转变为黄色。在450nm处测定吸光度值。吸光度值与样品中的克伦特罗浓度成反比。
2.2 试剂、用途及仪器、设备
竞争酶标免疫法试剂盒可用于定量测定尿、肌肉、肝脏等中的克伦特罗。试剂盒中包括了所有检测用的试剂，在使用前，请详细阅读试剂盒说明书。定量分析须用微孔板酶标仪（450nm）进行测量。
2.2.1 克伦特罗系列标准溶液（0ng/L，100 ng/L，300 ng/L，900 ng/L，2700 ng/L，8100 ng/L）
2.2.2 酶标板
2.2.3 抗克伦特罗的特异性抗体
2.2.4 酶标记抗原
2.2.5 缓冲溶液
2.2.6 酶基质/发色剂
2.2.7 反应停止液（1mol/LH2SO4）
2.2.8 微孔板酶标仪（450nm）
2.2.9离心机
2.2.10微型振荡器
2.2.11 微量加样器（20μl，50μl，100μl，200μl，250μl）
3 制样
3.1 样品的制备
取适量新鲜或冷冻空白或供试尿液，如尿样浑浊，则必须2000g离心10min，取上清液留用。
3.2 样品的保存
-20℃冰箱中贮存备用。
3.3 测定
测定之前将所有试剂回升至室温20℃—24℃，取解冻后的供试样品，2000g离心10min，取上清液，作为供试液。
3.3.1 测定程序（室温20℃—24℃条件下操作）
（1）将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。
（2）加入100μl稀释后的抗体溶液到每一个微孔中底部，在室温孵育15min。
（3）倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每行拍打3次），以保证完全除去孔中的液体，用250μl蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，重复操作两遍以上。
（４）精密吸取２０μl标准溶液及处理好的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行实验。
（5）加入100μl稀释的酶标记物到微孔底部，在微型震荡器上混匀，室温孵育30min。
（6）重复步骤（3）。
（7）加入100μl基质/发色剂到微孔中，在微量振荡器上充分混匀（或小心地在平面上转动酶标板以充分混合），并在室温暗处孵育15min。
（8）加入100μl反应停止液到微孔中，混匀。在60min内450nm处以空气为空白测定吸光度值。
3.3.2 结果判定和表述
按下式计算百分吸光度值：
百分吸光度值=B/B0×100%
式中：B—为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；
B0—为零标准的标准溶液平均吸光度值；
以X轴为标准溶液中克伦特罗浓度（ng/L）的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。从标准曲线上查出供试样品中克伦特罗的浓度（ng/L）。也可以用专业计算机软件求出供试样品中克伦特罗的浓度。
检测结果小于1000ng/L时判为未检出，大于或等于1000ng/Lg时判为可疑，需要复检后再确定。复检后小于或等于1000ng/L为未检出，大于1000ng/L为阳性。尿液稀释系数为1。
