（山东农业大学动物科技学院 泰安 271018）
摘要 本文简述了如何以胶体金免疫层析技术，构造鸡传染性法囊病快速诊断试纸。该试纸主要由测试端、显色区和手柄端3部分构成，能在很短的时间内完成对鸡传染性法氏囊病的诊断，且无需任何仪器设备，具有简便、快速、敏感、特异的特点。
关键词 鸡传染性法囊病；快速诊断试纸；胶体金；免疫层析
鸡传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病。自1957年在美国特拉华州的冈博罗首次发生IBD以后，几十年来，IBD已遍及几乎所有的养鸡国家，给各国的养鸡业带来巨大的经济损失[1]。目前该病的检测方法主要有琼脂扩散试验(AGP)、荧光抗体试验(FA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)以及斑点杂交技术(Dot Blot Hybridization)等，这些方法都局限在实验室进行，并且需要熟练的检测人员，给疾病的检测带来极大的不便[2]。如何快速地诊断IBD就成为一项艰巨的任务摆在我们的面前。为了建立快速、敏感、特异的IBD检测方法，本文探讨了如何利用胶体金免疫层析技术构造IBD快速诊断试纸。
1 IBD快速诊断试纸的原理
IBD快速诊断试纸首先利用的是免疫层析的原理，将抗原或抗体固定在层析介质上，相应的抗体或抗原通过毛细泳动，与特异性物质结合后即滞留在该位区，根据显色反应即可作出判定。显色技术利用的是胶体金免疫检显色，胶体金颗粒易于制备，当颗粒达到107/mm2时，即可出现肉眼可见的粉红色斑点，同时因其保存、使用方便而被广泛应用于生物学、医学等领域[3]。
2 IBD快速诊断试纸的构造
IBD快速诊断试纸根据胶体金免疫层析原理设计，由测试端、显色区和手柄端3部分构成，含有支撑层和反应试剂吸附层（图一）。测试端由玻璃纤维膜构成，吸附相应的抗原或抗体；显色区由硝酸纤维膜（NC膜）构成，其上含有判定结果的检测线和对照线（图二）；手柄端由吸水材料构成。
3 IBD快速诊断试纸的研制思路
在测试端玻璃纤维膜上包被金标记鼠抗IBDV单克隆抗体（Au-Ab1），在显色区NC膜的检测线和对照线处分别包被鼠抗IBDV单克隆抗体（Ab1）和兔抗鼠IgG多克隆抗体（Ab2）。
若待检液中含有IBDV，当待检液进入测试端时，其中的Au-Ab1和IBDV形成Au-Ab1—IBDV的复合物，复合物在NC膜上层析泳动，被检测线处的Ab1拦截，形成Au-Ab1—IBDV—Ab1的复合物，并在检测线处形成棕红色的条带；测试端多余的Au-Ab1在NC膜上继续层析泳动，被对照线处的Ab2捕获，形成第二条棕红色的条带。若待检液中不含IBDV时，测试端的Au-Ab1在NC膜上层析泳动，不能被待检线处的Ab1拦截，直接与对照线处的Ab2结合，仅形成一条棕红色的条带。
4 IBD快速诊断试纸的制作
4.1 鼠抗IBDV单克隆抗体的制备 用纯化的IBDV抗原免疫8日龄的Balb/c小鼠50ug/只，首次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原，加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化抗原，共免疫2—3次，每次免疫间隔2—6周。当用ELSA检测抗IBDV血清抗体效价＜10-4时，用50ug纯抗原尾静脉超强免疫，取脾细胞与骨髓瘤细胞在50%PEG作用下进行细胞融合，HAT选择培养基培养，随后进行阳性克隆筛选，经小鼠腹腔诱生腹水，proteinG柱层析提纯IgG[4]。
4.2 兔抗鼠IgG多克隆抗体的制备 首先将Balb/c小鼠的血清采用辛酸—硫酸铵法加以纯化，以获得较纯的小鼠IgG。具体过程为：离心后的1份血清用2份0.01M PH7.4 PBS稀释，边搅拌边加入50%饱和硫酸铵，4℃静置30min，6000r/min离心30min，沉淀用0.06 M PH4.8醋酸盐缓冲液溶解至原体积，室温下边搅拌边加入辛酸（30ul/ml血清），4℃澄清2h，13000r/min离心30min，弃沉淀。上清液调PH至7.4，在加入35%饱和硫酸铵沉淀蛋白质，重复两次。沉淀物用少量PBS溶解，4℃PBS透析过夜，其间换液3～5次。然后以获得的较纯的小鼠IgG作为抗原，加上适量的佐剂，免疫健康的家兔，取血清，再次用辛酸—硫酸铵法纯化，即制得兔抗鼠IgG多克隆抗体[5]。
4.3 胶体金的制备 将氯化金（又名氯酸金，HAuCl4）溶解于双蒸水中配制成0.01%的水溶液；取0.01%的HAuCl4水溶液加热至沸腾，迅速加入1%的柠檬酸钠水溶液4ml，约5分钟后出现橙红色，即制成所需要的胶体金颗粒，4℃备用。[3]
4.4 鼠抗IBDV单克隆抗体的标记 取1mg纯化的鼠抗IBDV单克隆抗体，边搅拌边注入到50 m1胶体金溶液中，室温下搅拌1 h。加10％牛血清白蛋白(BSA) 2 m1(终浓度为0.4％)，室温下搅拌5 min。加10％聚乙二醇〔PEG2000〕1m1(终浓度为0.2％)，室温下搅拌5 min 。12000～15000 r／min离心50 min，沉淀溶于5ml保存液中。用滤膜过滤， 4℃冰箱保存被用。
4.5金标记鼠抗IBDV单克隆抗体玻璃纤维膜的制备 取3 m1金标记鼠抗IBDV单克隆抗体，加3 m1稀释液混匀。放入玻璃纤维素膜浸泡10 min，取出置37℃烤箱中烤干，热合封口，置4℃冰箱备用。
4.6抗体硝酸纤维素膜(NC膜)的制备 在NC膜的检测线和对照线处分别包被鼠抗IBDV单克隆抗体和兔抗鼠IgG多克隆抗体。 将抗体硝酸纤维素膜置封闭液中，37℃水浴锅中孵育1h。取出抗体硝酸纤维素膜浸泡在洗涤液中洗2次，室温下风干，置4℃保存备用[6]。
4.7 IBD快速诊断试纸的组装 将所需材料剪成相应尺寸大小，即手柄端4mm×20mm，抗体硝酸纤维素膜( 显色区)4mm×20mm，金标记鼠抗IBDV单克隆抗体玻璃纤维膜4mm×5mm，待加样（即图一的max处）玻璃纤维膜4mm×15mm。
然后将这些材料组装成图一所示的IBD快速诊断试纸。
5 IBD快速诊断试纸的检测步骤
5.1 采样 取出待检鸡的法氏囊，置于某一容器内，然后加入生理盐水或干净的自来水，充分剪碎或匀浆，静置5min。
5.2 检测 从4℃冰箱取出IBD快速诊断试纸，恢复到室温；手拿试纸的手柄端，将测试端插入组织悬液得上清液中（勿使液面超过max线），NC膜吸满液体时，取出试纸平放1—5min，观察NC膜的显色情况。
5.3 结果判断 试纸的NC膜上出现两条棕红色线时，判为阳性，即该鸡感染IBDV；只出现一条棕红色对照线时（靠近手柄段）判为阴性，即该鸡未感染IBDV；不出现任何棕红色线时，表示操作有误或试纸失效。
6 IBD快速诊断试纸的应用前景
近年来，IBD已成为危害养鸡业的主要传染病，由于IBD感染的鸡群多呈亚临床感染和其它病原体混合感染而影响确诊，使临床剖检和常规的AGP方法难以满足临床诊断的需要。而IBD快速诊断试纸使用方便，并且具有快速、敏感、特异的特点，因此具有广阔的应用前景。相信在不久的将来，IBD快速诊断试纸必能广泛应用于生产实践中，为IBD的快速诊断做出应有的贡献。另外，我们利用胶体金免疫层析技术，还可研制出其他疾病的快速诊断试纸，使之更好地为动物检疫、疾病的防治服务。
参 考 文 献
1 蔡宝祥主编，家畜传染病学，中国农业出版社，1999，269~271.
2 庄向生，等.中国兽医科技，1994，24：3~5.
3 殷震，等主编. 动物病毒学，科学出版社，1997，278~282.
4 杜念兴主编.兽医免疫学，中国农业出版社，1999，56~58.
5 王毅.河北医药，1994，16：381~382.
6 魏梅生，等.植物检疫，2002，2：81~83.
