（一）、安全性考虑
家禽及其产品是人类食品结构的重要组成部分，因此对于DNA疫苗的使用，必须考虑到其对禽类本身及对人类的潜在危害性。目前对DNA疫苗的安全性考虑主要基于以下四个方面：（1）质粒DNA低水平整合到宿主基因组的潜在危险性；（2）DNA疫苗载体携带的抗生素基因可能导致的生物学后果；（3）产生针对双链DNA的抗体；（4）引起免疫耐受。
外源DNA随机整合入宿主基因组，可能会激活癌基因或者使肿瘤抑制物失活。此外，外源DNA被干细胞或生殖细胞摄取之后还可能将外源DNA传给后代。但是迄今为止尚未发现质粒DNA整合入基因组DNA的直接证据，仅有Schubbert等的一篇报道表明在小鼠脾细胞、肝细胞及肠细胞中检测到降解的质粒DNA片段。
一般用作DNA疫苗的真核表达载体为了筛选方便都带有一个抗生素抗性基因，最常用的是氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性基因，抗生素抗性基因的存在有可能导致致病菌的耐药性问题，但是如果能够对特定抗生素抗性基因的使用作出一个通用的规定，那么这个问题也应该可以解决。
到目前为止，在人和小鼠都曾经检测到针对dsDNA的抗体，这可能是由于长期自然接触细菌DNA引起的，而且这种抗体与哺乳动物DNA之间没有交叉反应，但是人们还是不免会担心长期暴露于质粒DNA是否会诱导产生针对dsDNA的抗体，从而引发自身免疫性疾病。FDA生物学评估中心（Center for Biologics Evaluation Research, CBER）进行的研究中，正常小鼠多次免疫之后，确实可以激活分泌针对自身DNA抗体的自身反应性B细胞，这种自身反应性抗体的量最大可升高4倍，但是尚不足以对正常小鼠引起任何异常反应。另外，也没有观察到针对表达外源抗原的肌细胞和DC的免疫反应。但是不同的DNA疫苗之间可能有差异（如表达不同的抗原），因此必须通过临床前研究加以验证。
关于DNA疫苗是否能够引发新生动物免疫耐受的研究结果不尽一致。有研究表明，新生小鼠免疫编码疟原虫环孢子体蛋白（Circumsporozoite protein, CSP）的质粒可诱发长期的免疫耐受,进一步的研究证明，这种诱发免疫耐受的机率随免疫剂量的增加和动物年龄的降低而增高，且是非MHC依赖性的。但是编码流感病毒、狂犬病毒、乙肝病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒抗原及其他疟原虫抗原的DNA疫苗均不能诱导免疫耐受。此外，在成年动物也未观察到由DNA疫苗引发的免疫耐受现象。这些都提示DNA疫苗是否诱发免疫耐受可能与编码抗原、动物年龄以及免疫次数有关。
针对上述四种潜在的危害性，美国FDA、WHO及EU都对DNA疫苗的研制制定了一些指导性规定[82], 为DNA疫苗的研究、生产及应用指明了方向。
（二）、研制价格低廉、实用化的禽用DNA疫苗
在人的DNA疫苗应用研究方面，已经取得了很大的突破。美国FDA已批准流感、结核、疟疾、乙肝等数种DNA疫苗做临床应用研究，其中结核和疟疾的DNA疫苗已获准生产，我国也有10余种核酸疫苗进入了临床前研究。但是目前，有关禽类DNA疫苗的研究仅局限于实验室阶段，到临床应用还有很长的一段路要走。究其原因，主要是由于DNA疫苗代价相对较高，且不适于集约化养殖的群体免疫。因此开发出价格低廉、实用化的DNA疫苗是决定其是否能在家禽应用的关键，大致可以从以下两个方面来解决：
1、改进DNA疫苗生产工艺
由于基因枪免疫法在家禽应用有它的局限性，而常用的肌肉注射法又存在DNA摄取效率低，需要的免疫剂量大的缺陷，因而，寻找一种简便、高效、价廉、适合大规模制备高纯度质粒DNA的方法非常必要。在这方面，有人已经进行了一些探索，通过离子交换色谱法（Ion exchange chromatography）或亲水相互作用色谱法（Hydrophobic interaction chromatography）[85-86]对质粒制备方法进行探索，取得了较好的效果，可以获得高纯度的质粒DNA，完全可以满足DNA疫苗对纯度的要求，而且适合于规模化制备，是一种很有前景的方法。
2、优化DNA疫苗的接种方式
DNA疫苗的接种方式不仅会影响免疫反应的强度和免疫应答的类型，而且直接决定了疫苗应用的实际可操作性，通过对现有文献的整理分析，笔者认为有以下几种方式有可能得到实际应用：
⑴、以减毒胞内菌作为DNA疫苗的运送载体：
利用基因工程减毒的某些侵袭性胞内菌作为载体运送DNA疫苗是一种新型的途径。常用的减毒胞内菌有鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志贺氏杆菌(Sheigella flexneri)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、侵袭性大肠杆菌(invasive E.coli)、分支杆菌(M.bovis Bacille Calmette-Guèrin, BCG)及单核细胞增生症李斯特菌(Listeria monocytogenes)等。通过减毒胞内菌运送DNA疫苗的最大优势就在于其能够将DNA疫苗直接运送到专业性抗原提呈细胞(巨噬细胞和树突状细胞)内，细菌在APC中裂解后，将携带的质粒DNA释放出来。其中鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及单核细胞增生症李斯特菌对巨噬细胞有很强的偏嗜性,而且还能够直接向DC细胞运送DNA疫苗,与其他单核细胞相比，DC具有更强的抗原提呈能力。作为细菌组成成分的LPS和未甲基化的CpG基序还可以作为佐剂增强DNA疫苗的免疫原性。另外，用减毒胞内菌作为运送载体可以通过口服或滴鼻途径进行免疫，从而有利于激发粘膜免疫反应。目前，应用减毒胞内菌运送DNA疫苗的途径已在小鼠和鱼类模型中进行了广泛的研究，取得了一些令人振奋的结果。在禽类尚无类似报道，但是已经有了一些比较好的减毒沙门氏菌菌株被用作弱毒苗预防禽类沙门氏菌感染或作为禽类疫苗的原核表达载体, 但是这些减毒疫苗株是否适于用作禽类DNA疫苗的运送载体，还需要通过研究证实。
⑵、体表免疫
皮肤已经被证明是一个重要的免疫器官, 通过体表涂布的方式进行DNA疫苗的免疫也是近两年刚刚兴起的一种免疫方法，在小鼠及其他一些动物模型中均取得了较好的应用效果。因此在鸡，通过该途径进行免疫也应该是切实可行的。Keckert等用表达绿色荧光蛋白的表达载体与等量DMSO混合，以50μg的剂量对4周龄鸡进行翼部皮肤表面涂布，2天后在接种部位的皮肤，接种部位深层肌肉、心脏、肺和脾脏中均检测到GFP的表达，表明免疫后质粒DNA在体内得到广泛分布和功能性表达。用同样的方法免疫编码NDV HN基因和编码IBDV VP2/VP4/VP3基因的表达载体，不仅检测到全身和粘膜免疫应答，而且产生了很好的免疫保护效率(均为86%)。
⑶、卵内接种(in ovo immunization)
在过去的10年中，卵内接种已被广泛用于某些家禽病毒性疾病的疫苗接种。1997年Johnston等通过肌肉注射途径对鸡胚进行DNA疫苗接种，检测到报告基因表达。2000年Oshop等对该方法进行了改进，于17日龄时将编码GFP的表达质粒DNA用中性脂质体包裹后与DMSO等量混合，通过鸡胚气室上打的小孔将混合物滴加到壳膜上，在肺、肌肉、脾脏等不同的组织器官中均检测到GFP表达，将GFP基因替换为NDV的HN基因和IBDV的VP2/VP4/VP3基因后用同样的方法免疫，通过免疫组化的方法可以检测到病毒抗原的表达，而接种空载体作对照的鸡胚未检测到抗原表达，说明这种接种方法对DNA疫苗是有效的。
八、结语
大量的研究为DNA疫苗在禽病防制中的应用展示了美好的前景。但是DNA疫苗的概念对于家禽业而言还只能算是一个雏形，还有相当多的问题亟待人们去解决。比如DNA疫苗在禽类激发的免疫应答的机制是什么，我们怎样才能对免疫应答的类型进行调控，什么样的接种途径最适合规模化养殖家禽免疫接种的需要等等。但是归纳为一点，DNA疫苗要想真正进入商业化生产中应用，必须符合这样一个标准：价格低廉，易于操作，能够产生足够的免疫保护力。相信在禽病学家和免疫学家的共同努力下，最终肯定能找到一条把家禽DNA疫苗推向生产应用的有效途径。
