断奶仔猪腹泻（post-weaning diarrhea，PWD）和猪水肿病（porcine edema disease，ED）是两种导致仔猪死亡的重要传染性疾病，目前已成为养猪业有重要意义的疾病。ED和PWD常发生于同一个猪群，并且病原菌的毒力因子也有相同之处，都是由具有某种粘附因子并能产生一种或多种外毒素的大肠杆菌菌株引起,这些粘附因子可使大肠杆菌定殖于小肠。它们大多属于有限的几种血清型。在一给定的区域内，血清型与一套相当恒定的粘附因子和毒素紧密相关。引起PWD 和ED的大肠杆菌主要产生F4（K88）和F18两类粘附素，同时也可产生类志贺毒素2变异体（Stx 2e）。
ED是仔猪一种较常见的传染病，主要发生于断奶一周左右的仔猪，是由产vero细胞毒素大肠杆菌引起的传染性肠毒血症，其O血清型主要为 O139，其次为O138和O141。病猪常出现一系列的神经症状，如共济失调，惊厥和后肢瘫痪等典型症状；死亡剖解可见皮下组织、肠系膜、胃大弯粘膜下层水肿等。该病发病率较低，但死亡率可高达90%以上，给养猪业造成了相当大的经济损失。随着近几十年的深入研究，人们对水肿病的致病机理有了比较详细的了解，明确了猪水肿病的发生与大肠杆菌的两个主要毒力因子：F107（现称F18ab）菌毛及类志贺毒素2变异体（Stx 2e）密切相关。PWD常发生于断奶后至12周龄，特别在断奶后14天内易发。PWD也是引起断奶仔猪死亡的重要原因之一，死亡高峰通常在4-10周龄。PWD主要特征为患病仔猪拉淡黄或灰白稀粪，常持续1周或1周以上，仔猪逐渐消瘦，脱水，精神沉郁，食欲减退，被毛粗乱，部分仔猪死亡。引起断奶仔猪腹泻的大肠杆菌国内几乎没有报道。国外报道的血清型主要有O149，O8，O138，O139，O141，O147，O157等。其致病性主要与该类细菌表面菌毛F4或F18ac及此类菌株产生的Stx 2e有关。引起ED和PWD的大肠杆菌的发病机理是一致的：仔猪断奶后，由于断奶应激，体内母源抗体的逐渐消失，消化道内环境的改变，以及饲养管理、营养条件、环境因素的忽然改变，导致机体的抵抗力下降，当易感仔猪感染病原性菌后，细菌通过其自身的菌毛附着于小肠绒毛上，从而在小肠内定居，并开始大量生长和繁殖，在这过程中产生毒素并被吸收，从而引起一系列临床症状并导致仔猪死亡。在丹麦，（Ojeniyi 等1994，Ripying等，1995）28至49日龄断奶仔猪腹泻样品中分离到的184株致病性大肠杆菌中，F18和F4分别占44%和36%；在德国， Wittig等从PWD和ED病例中分离到的380株大肠杆菌中F18ab和F18ac分别占40%和35%，F4占14%。PWD和ED都是由毒素引起的，从致死病例中分离到的大肠杆菌几乎全部为产毒素型（Imberechts等，1994；Wittig等1995）。Osek等（2000）从波兰致PWD病例中所分离到的46株大肠杆菌中有34株（73.9%）可产生Stx 2e；Imberechts等（1992）用PCR技术对28个致ED大肠杆菌标准株和分离株进行了F18主要亚单位A的结构基因fedA和stx2e基因的检测，结果fedA 阳性者24株（占85.7%），其中的20株（83.3%）同时含有stx 2e基因。Osek等利用PCR方法对fedA基因进行检测，发生61.9%的致断奶仔猪腹泻分离株以及84.2%的致猪水肿病分离株都含有fedA基因。鉴于F4、F18粘附素在致PWD和ED大肠杆菌中的高出现率及与Stx 2e间较高的相关性，可以认定F4、F18和Stx 2e是上述大肠杆菌的的主要致病因子。
除流行病学调查之外，国外在PWD和ED的致病、免疫机理方面也有部分报道。Imberechts等（1992）以F18ab基因转化大肠杆菌HB101，形成了可吸附于猪肠道上皮细胞的菌毛，而构建的FedA阅读框无意义突变株则丧失了菌毛表达和对猪上皮细胞吸附的饿能力；Macleod等（1991）以纯化的Stx 2e在SPF猪复制出了水肿病，同时，以Stx 2e主动、被动免疫的SPF猪在攻毒后均得到了保护；Jackson等（1990）进一步的研究表明，Stx 2e B亚单位的N-末端附近的亲水区与毒素的结合作用有关。这些结果进一步证明了F18粘附素和Stx 2e在PWD和ED的发生中起着决定性的作用。
一、F18菌毛
引起猪水肿病的大肠杆菌在肠道中的定居通常依赖于F18菌毛。F18ab菌毛是Bertchinger等在研究两株致猪水肿病的大肠杆菌（O139：K12：H）菌株107/86及124/16中发现的一种新型粘附素菌毛，在体内和体外均可介导大肠杆菌吸附于易感断奶仔猪小肠上皮且吸附作用不被甘露糖所抑制，其抗原性与已知其它粘附素K88、K99、987P和F4不同，这种菌毛被命名为F107；该菌毛不凝集包括豚鼠在内的多种动物的红细胞，在普通培养基上不表达或根本不表达，电镜观察显示该菌毛较长而易弯曲，直径为4.6nm。血清学检查和分子杂交的结果显示，分离自水肿病猪大肠杆菌的血清型为O138、O139、O141、O147、O157、O16和O108具有溶血性的菌株大部分可表达F107菌毛。Nagy等在匈牙利从腹泻的断奶仔猪的粪便中分离到一些血清型为O141，O157大肠杆菌菌株，发现其表面粘附素不同于其他已知的任何一种粘附素，命名为2134P，直径为3.5nm，菌毛化的细菌在体内体外都能粘附于3周龄而不是新生仔猪的小肠绒毛。利用多抗和单抗同时检测F107、2134P菌毛，表明两者有部分相同的抗原决定簇，Witting等将之命名为“a”，而将在F107/86和2134P菌株上各有特异的决定簇分别命名“b”和“c”。免疫电镜试验表明“a”和“b”或“a”和“c”沿同一菌毛分布；分别针对共同的抗原决定簇“a”和特异性抗原决定簇“b”或“c”的抗血清在免疫印迹试验中均可识别分子量约为15kD的蛋白条带[12]。Salejka等[13]报道在血清型O25、O45、O108、O141、O147和O157产肠毒素大肠杆菌上发现一种新型定居因子8813菌毛。8813菌毛无血凝性，在体外能凝集离体猪的肠上皮刷状缘。后经证实8813菌毛与2134P菌毛属同一类型，哥本哈根的国际大肠杆菌研究中心将这一系列相似的菌毛命名为F18菌毛，F107菌毛命名为F18ab菌毛，与仔猪水肿病有关；而将2134P菌毛、8813菌毛命名为F18ac菌毛，与断奶仔猪腹泻有关。现已明确编码F107的基因位于大肠杆菌染色体6上，并且已经被克隆。F107菌毛由多个亚单位组成，目前已鉴定亚单位由A、E、F等。其中A亚单位（FedA）是菌毛的主要结构亚单位，亚单位E、F编码基因其编码基因fedE和fedF位于fedA基因的下游。Smeds等（2001）利用融合蛋白对F18菌毛粘附特征作了进一步研究表明，纯化的fedF的基因融合蛋白（MBP-FedF）可粘附于离体猪肠上皮细胞，其抗血清则可阻断质粒pIH120转化菌HB101对离体猪场微绒毛的吸附作用。而纯化的fedC和fedE的基因融合蛋白及其抗血清却没有这些作用。表明fedF的基因编码菌毛粘附素。在fedA基因和fedE基因之间存在两个有部分重叠的开放阅读框，分别命名为fedB基因和fedC基因，两者都有一个分泌跨膜蛋白的前导信号肽和一个在第23和第24个氨基酸间的信号肽酶酶切位点。编码蛋白分子量分别为86.001kD和23.418kD。fedB基因、fedC基因和fedE的基因的作用尚在研究之中。 FedA亚单位的编码基因fedA为一个具有170氨基酸的开放阅读框（ORF），起始于160位的CTG密码子。在这个ORF中，含有一个由21个氨基酸组成的信号肽，编码序列于160-222bp位置，不包括信号肽，fedA氨基酸序列的分子量大约15099D。2134菌毛分子量为17kD，F18ac菌毛的编码基因尚未明确，但纯化的2134P显示的氨基酸成分与F107菌毛有区别，但两者氨基酸N-末端部分由很高的同源性（25/27-92.5%）。芦银华等通过对F18ab和F18ac两种菌毛A亚单位基因（fedA）的克隆和序列测定比较，发现F18ab与F18 ac的fedA基因的核苷酸序列同源性为97.6%，氨基酸的同源性为94.7%，同时F18ac的fedA基因与F18ab的fedA基因相比，核苷酸序列的下游第363bp处多出了CCG3个核苷酸，并由此出现了一个新的酶切位点NgoⅠ（CGGCCG），核苷酸的变化可能引起相应氨基酸的改变，因此，可以推测F18ab与F18ac的抗源性的差异可能就是由此引起。
二、F4（K88）菌毛
1961年φrskov等首先发现了致病性大肠杆菌的第一种菌毛具有粘附特性的K88菌毛，该菌毛不耐热，故当时归类于不耐热荚膜抗原K88（L）。后来确认其本质为蛋白质粘附素，是甘露糖抗性菌毛（MRHA）。在φrskov（1983）等建立的分类和命名体系中确定为F4。F4在TSA培养基37℃有氧环境下能很好表达菌毛，而在18℃培养时不表达菌毛。F4菌毛的直径约为2.1nm，电镜下菌毛为丝状、柔毛样结构，分布菌体表面。利用特异性抗血清φrskov等将F4区分为F4ab和F4ac两种血清型，后来又出现了一种新的血清型F4ad。F4菌毛结合仔猪小肠上皮刷状缘的受体有三种，即肠粘液型唾液酸糖蛋白（IMTGP），肠中性鞘糖脂（IGLad）和运铁蛋白的糖蛋白（GP74）。已发现仔猪的刷状缘细胞的遗传表型不同，对F4的三个变异血清型（F4ab、F4ac、F4ad）的粘附抵抗力也有差异。对F4+菌易感的仔猪表型为“粘附型”（表示F4+菌能粘附其刷状缘），反之为“非粘附型”。这两种表型受同一位点上的一对等位基因控制，其遗传服从孟德尔规律。三种变异血清型都有一个共同的抗原决定簇“a”。F4血清型的变异有两种解释：一是因为临床上F4+灭活疫苗及减毒疫苗的广泛使用给细菌造成了巨大的免疫压力，从而使其发生了变异；二是猪肠道上皮细胞上的受体发生了改变，这种解释与Bijlsma等发现的不同F4血清型有各自不同的结合位点现象一致。但近几年从感染发病猪中分离到的F4均为F4ac或F4ab，Fab有逐渐消失的趋势。在韩国，Chang Sun Cho等[18]对812株腹泻猪中分离到的大肠杆菌以PCR方法进行了鉴定发现96%为F4ac，2%为F4ab。不同分离株的F4菌毛在SDS-PAGE中呈现一条带，其近似分子量为23.5~26kD，不同血清型，其分子量也不同。F4菌毛虽然由上百种蛋白亚单位组成，但不同血清型之间的氨基酸序列却相差甚微。与F4菌毛生物合成有关的基因簇可包括10个（faeG~faeJ），如图所示。除了faeA和faeB是两个调节基因外，其余8个基因（faeC~faeJ）都是F4菌产生所需的结构基因，且分别用一个信号肽序列合成各自的多肽产物。faeG编码的FaeG是菌毛的主要亚单位蛋白，与菌毛的粘附特性有光。faeD编码的FaeD蛋白是一种外膜蛋白，与菌毛亚单位的转运有关。FaeE编码的FaeE蛋白是一种周质伴侣蛋白，其余faeC、faeF、faeH、faeI和faeJ分别编码的五种多肽，都是菌毛结构的次要成份。
据Huisman等（1994，1995）的研究报道，在fae（K88）操纵子上存在一个背驰转录的调节基因（divergently tranciribed regulatory gene），fedA和fedB，并被二个反向的IS插入分隔。FedA是一个负调节基因，dB是正调节基因。前者的负调控作用是通过FedA和亮氨酸效应调节蛋白（leucine-resposive regulatory protein Lrp）对fae调节区的协同结合活性来实现的。后又发现，这种负调控还依赖于fae调节区内的三个GATC位点（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）的甲基化状态。GATC位点Ⅰ的甲基化可防止Lrp/FaeA 在该位点的结合，GATCⅡ位点和Ⅲ位点的甲基化会降低Lrp/FaeA结合的稳定性，但GATC位点Ⅲ的甲基化能刺激faeB启动子的活性。据推测，二个IS插入的存在能消除Lrp/FaeA对K88生物合成的部分抑制作用。另外K88ab的重组质粒表达K88ab时，主要靠PBR322的P启动子。在K88ab的操纵子的faeC与faeD之间有一个二重对称区，但其mRNA的茎-环结构不太稳定。K88ab的主要亚单位在该二重对称区的下游，所以茎-环结构不太可能起到终止作用，而是由FaeD的起始密码来完成。不过，这种茎-环结构可能起着rho依赖性终止子的作用。同时，还含有FaeD多肽的起始位点，与K88ab菌毛的温度依赖性合成有关。在低温状态下，杆状结构趋于稳定，阻止了faeD基因转译的起始。
三、类志贺毒素2型变异体（Stx 2e）
1950年Timoney等将发生水肿病的肠道内容物离心后的上清静脉注仔猪可复制出水肿病，因而证实了水肿病不是由细菌直接引起的，而是其产生的一种毒性物质引起的，这种毒性物质存在于患病猪的肠道中。1974年Nielsen和Clugston首次纯化和证实了该毒素是一种蛋白质，对热敏感，并可复制出典型的神经症状和动脉损伤。Macleod和Gyles（1990年）建立了一种毒素纯化的最佳方案，并证实了毒素是由两个分子量不同的亚单位组成（35kD和7.5kD），对Vero细胞具有毒性，可致死小鼠，能完全复制出仔猪水肿病。Dobrescu等研究发现该毒素和人源大肠杆菌菌株产生的Vero细胞毒素密切相关，而又有所区别，因而将其列为类志贺样毒素家族。通过与志贺氏菌Ⅰ型毒素的抗原交叉反应确定的两种主要类型的类志贺样毒素，即类志贺样毒素1型（StxⅠ）和类志贺样毒素2型（StxⅡ类志贺样毒素），StxⅠ和StxⅡ对Vero细胞和Hela细胞都具有毒性，而水肿病毒素对Vero细胞有较强的毒性作用而对Hela细胞较弱，而且水肿因子比StxⅠ和StxⅡ更不耐热，它不能被StxⅠ的抗血清中。由于该毒素能被StxⅡ的抗血清中和，因而水肿病毒素被命名为类志贺样毒素Ⅱ型变异体（Stx 2e），它同时具有细胞毒性和神经毒性。Stx 2e的基因目前已被克隆并测序，Stx 2e操纵子全长为1980bp，它由两个亚单位基因组成—stx 2eA和stx 2eB。stx 2eA位于242bp到1199bp核苷酸之间，其中242bp到307bp核苷酸片段为前导序列；stx 2eB位于1214bp到1474bp之间，1214bp到1270bp核苷酸片段为前导序列。在stx 2eA和stx 2eB之间为一个15核苷酸的非翻译区。两个RBS分别位于第228bp位核苷酸处和1203bp位的核苷酸处，分别控制Stx 2e A和Stx 2e B 的翻译。Stx 2e的核苷酸序列与志贺氏菌毒素StxⅠ和StxⅡ的比较结果显示：Stx 2e与StxⅡ之间有很高的同源性，stx 2e A与stx 2A的同源性可达95%，stx 2eB与stx 2eB同源性可达79%。Stx 2e和类志贺毒素结构组成相似，都是由一个分子A亚单位和五个分子B亚单位的聚合体，如图3所示。A亚单位包括297个氨基酸，分子量为33.050kD，是Stx 2e的主要毒力亚单位，是毒素的酶活性部位，它具有细胞毒性作用，可终止真核细胞的蛋白合成。A亚单位的空间结构影响其毒力和酶促活性；B亚单位由68个氨基酸组成，分子量为7.566kD，通过定点突变表明对vero细胞受体发挥作用的氨基酸位于Stx 2e B处。其不具有酶活性作用，但具有免疫原性。Stx 2e B可识别肠上皮细胞上的特异性受体并与之相结合，从而使Stx 2e可以通过“脂流”进入细胞内。受体的化学本质已经明确。其特异性受体为球状三酰基（神经）鞘氨酸（Gb3）、球状四酰基（神经）鞘氨酸（Gb4）和半乳糖红细胞糖苷酶（Fb5），但Stx 2e B与Gb3结合较弱，而与Gb4和Fb5结合力较强。Gb3是空肠和Hela细胞上的主要受体，而Gb4主要存在于猪小肠上皮细胞及vero细胞上，Fb5只发现于vero细胞，这一点也就解释了为什么Stx 2e对vero细胞有较强的毒性作用，而对Hela细胞的毒性较弱的现象。Waddell等研究表明在猪体肝脏、结肠、回肠、小脑、脑脊髓等部位可结合Stx 2e，利用单克隆抗体进一步证实Stx 2e主要结合于这些器官组织的上皮细胞和血管平滑肌细胞上。已经证明Stx 2e可阻遏猪主动脉内皮细胞的蛋白质的合成，这也说明内皮组织具有Stx 2e的特异性受体。
目前，ED是我国养猪业的大敌之一，每年给我国养猪业带来的经济损失不可低估。除ED外，由于PWD在我国的研究尚属空白，其对我国养猪业造成的经济损失更难估计。可以设想，PWD、ED对我国养猪业带来的损失是不可忽视的。
目前，在PWD和ED的预防方面，国外以Stx2e抗毒素被动免疫和用其类毒素作主动免疫后攻毒，取得了令人满意的免疫效果。近几年有学者用提纯的F18菌毛免疫母鸡，制得针对F18的卵黄抗体，在体外能抑制F18菌株对猪肠粘膜的吸附，在体内则可对攻毒提供保护。断奶前给仔猪经口接种大肠杆菌，据Fahy等（1992）报道可提供对PWD的部分保护力。Turnes等（1999）用含有F4主要亚单位FaeG的结构基因fedG的重组质粒免疫实验小鼠和实验猪，在两者体内均诱导产生了较高的抗体水平。但至今为止，在临床上还没有普遍有效的预防措施，因为PWD和ED在连续几批断奶仔猪和同步断奶仔猪发生的不可预见性，预防措施的效果难以评价。选育有抵抗力的猪从长远来看是，这种方法最有效也是最经济的。但还没有用于确定活猪基因型的方法，选育工作还行不通。因此，研制出一种能同时诱导机体产生粘膜免疫、体液免疫的基因工程活疫苗，无疑具有重要意义。
