饲料中硒的测定方法 2,3-二氨基萘荧光法

1 主题内容与适用范围
　　本标准规定了用 2，3-二氨基萘（DAN）荧光法测定饲料中硒的方法。
　　本标准适用于配合饲料、预混合料、浓缩饲料和单一饲料中硒的测定。在萃取液中检测范围为 0.001～0.1 μ g／ mL （以Se计）。
2 引用标准
GB 1.4 标准化工作导则 化学分析方法标准编写规定
GB 6682 实验室用水规格
3 方法原理
　　先将试样中有机物破坏，使硒游离出来，在微酸性溶液中硒（ IV）和2.3-二氨基萘（DAN）生成4.5-苯基苯并硒二唑，用环己烷直接在生成络合物的同一酸度溶液中萃取，用荧光光度计测定其荧光强度。
　　实验室用水应符合 GB 6682中二级用水的规格，使用试剂除特殊规定外，应为分析纯。
4.1 高氯酸 优级纯（ ρ 1.67g／ mL ）。
4.2 硝酸 优级纯（ ρ 1.42g／ mL ）。
4.3 环己烷 ρ 0.778～0.80g／ mL 。
4.4 盐酸 优级纯（1+3）。
4.5 盐酸 C （ HCl ） ＝0.1mol／L。
4.6 氨水 ρ 0.90g／ mL 。
4.7 盐酸羟胺-乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液
　　称取 10gEDTA溶于500mL水中，加入25g盐酸羟胺使其溶解，用水稀至1000mL。
4.8 2，3-二氨基萘（DAN）溶液
　　称取 DAN0.1g于150mL烧杯中，加入100mL0.1mol／L盐酸使其溶解，转移到250mL分液漏斗，加入20mL环己烷（4.3）振荡1min，待分层后弃去环己烷，水相重复用环己烷处理2～3次。水相放入棕色瓶中上面加盖3mm厚的环己烷，于暗处保存，此液可使用数周。
4.9 硒标准贮备溶液
　　称取硒粉（纯度 99％以上）25mg（精确至0.01mg），入100mL烧杯中，加入10mL硝酸加热溶解，冷至室温，用水转移至1000mL容量瓶中并稀至刻度，摇匀，此液 1mL含25.00 μ g的硒。
4.10 硒标准工作溶液
　　吸取（ 4.9）溶液1.00mL、入50mL高型烧杯中按分析步骤消化至高氯酸冒烟 5min，取下稍冷，加1mL水和1mL盐酸（4.4）摇匀，放置10min用盐酸（4.5）转移至250mL容量瓶中并稀至刻度摇匀，此液1.00mL含硒0.1μg。
4.11 甲酚红
0.4g／L水溶液，称取0.1g甲酚红入400mL烧杯中，加少许水加氨水（4.6）使其溶解用水稀至250mL，摇匀。
5 仪器、设备
5.1 荧光光度计
　　激发波长 365～385nm，荧光发射波长520～525nm，1cm石英比色杯。
5.2 实验室用样品粉碎机
　　标准分析筛孔径（ 0.42、0.25mm）。
5.3 分析天平分度值0.0001g。
5.4 可调温电炉（600W）或电热板（3000W）。
5.5 高型烧杯50mL和相应大小的表面皿。
5.6 具塞比色管50mL。
5.7 刻度吸量管2mL、10mL。
6 试样的制备
　　取已粉碎至 0.42mm的试样40～50g入250mL烧杯中加水至能搅动的糊状，在搅拌器上搅10～15min，倒在小搪瓷盘中铺平，放入烘箱70℃烘干，粉碎机上磨至0.25mm，混匀装入密封容器中备用，防止试样成分变化。
7 分析步骤
7.1 试样测定（配合饲料、浓缩料、单一饲料）
　　称取已制备好的试样约 1g，精确至0.0001g（≤0.4 μ gSe），放入50mL高型烧杯中，用少量水润湿试样加硝酸（4.2）10mL，轻摇烧杯使试样散开，加盖表面皿放到电热板（5.4）上低温加热见反应开始（泡沫开始上冒），切断电源或取下待剧烈反应缓解（气泡不上涌）后再放到电热板上煮沸至硝酸体积减少到5mL左右，取下稍冷加入5mL高氯酸（4.1）继续加热至剧烈小气泡冒完，高氯酸冒烟；取下稍冷，用水吹洗表面皿和杯壁，去掉表面皿，将烧杯置电热板上先低温蒸发水分，再升温至高氯酸冒烟并保持5～10min，取下稍冷，加入1mL水和1mL盐酸（4.4），摇匀，放置10min，水稀至30mL左右，加二滴甲酚红（4.11），用氨水（4.6）中和至黄色，再用盐酸（4.4）中和至橙色（pH1.5～2），加入3mL盐酸羟胺溶液（4.7）摇匀，用盐酸（4.5）转移到50mL比色管中（5.6），加2mLDAN 溶液（4.8），盖好塞子，摇匀，松动塞子，置于100℃水中保持5min。取出放入冷水中迅 速冷却至室温，用盐酸（4.5）稀至50mL，加5mL环己烷（4.3）振荡1min，静置分层后，用吸管小心吸取上部环已烷入1cm石英杯中，置入荧光光度计内于激发波长375～380nm，发射波长520～525nm测其荧光强度，在标准曲线上查得试料中硒的含量。
　　同时做空白试验（消化时应戴防护眼镜）。
7.2 高含量硒样品（预混合料）的测定
　　对于每千克含硒在 1mg以上含有机物的样品，按（7.1）进行至加入1mL水和1mL盐酸（4.4）摇匀，放置10min后将消化液稀释至足够体积，然后取部分溶液（Se≤0 .4 μ g）进行测定。对于以石粉为载体的预混料，称取1～5g样品（精确到0.0001g），于 250mL烧杯中，加入20mL水和25mL硝酸（4.2）（逐滴加入硝酸至气泡不发生后再全部加入），盖表面皿，置电热板上煮沸，低温沸腾30min，取下冷却，用水转移到100～500mL容量瓶中稀释至刻度，摇匀，取部分澄清液（Se≤0.4 μ g）入50mL高型烧杯中，加入5mL高氯酸（4.1），以下按7.1 加高氯 酸后程序进行。
7.3 工作曲线的绘制
　　取 0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，3.00mL硒标准溶液（4.10），分别入50mL具塞比色管中，加入3mL盐酸羟胺溶液（4.7）、2滴甲酚红指示剂（4.11），以下按7.1用氨水中和起操作进行，以下按7.1用氨水中和起操作进行，以硒量为横坐标，荧光强度为纵从标，绘制工作曲线。
8 分析结果计算和表述
　　硒的含量（ mg／kg）按下式计算：
Se （ mg／kg）＝ m 1 V 0 ／（ m 0 V 1 ）
式中： m 1 ──
自工作曲线上查得的硒量，μ g；
V 0 ──
试液的总体积， mL ；
V 1 ──
分取试液的体积， mL ；
m 0 ──
试料的质量， g。
　　所得结果应表示至三位小数： 0.001mg／kg。
9 允许差
　　室内每个试样应称两份试料进行测定，以其算术平均值为分析结果，其间分析结果的相对偏差应不大于下表所列允许差。
硒含量，mg／kg 允许偏差，％
≤0.100 40
＞0.100～0.200 30
＞0.200～0.400 20
＞0.400 15