内源氨基酸测定技术评定

        
  摘要：氨基酸的真消化率是评价饲料蛋白生物学效价的重要指标，而要测定氨基酸的真消化率，就必须对内源氨基酸排泄量进行估测。本文就目前内源氨基酸的测定方法进行了综述，并对各种方法的优缺点进行了评述。在内源氨基酸的测定方法中，以传统方法（无氮日粮法、回归外延法、和完全可消化蛋白源法）最为常用，但存在重大的缺陷。为克服传统方法的缺陷，学者们提出了新的估测内源氨基酸的方法，如同位素标记法、高精氨酸法、肽营养超滤技术、氨基糖测定法以及体内体外结合测定法等，但这些方法也存在或多或少的缺陷，还有待于改进。

    关键词：内源氨基酸；排泄量；测定方法 
                       
        氨基酸的消化率是评定单胃动物饲料蛋白质营养价值的重要参数。在氨基酸的消化率中，回肠末端真消化率因其有更好的可加性（Nyachoti等，1997）、合理性和准确性而被广泛采用，而要测定回肠末端真消化率，就必需正确评估动物的内源性氨基酸的排泄量。目前，内源性氨基酸的测定方法主要有以下几种。

         1.内源氨基酸测定的传统方法 
                       
         内源氨基酸测定的这几种方法都不能与原料的测定同时进行，因此也有人称之为“非生理状态测定法”，且把用此法测出的内源氨基酸含量称为“最低内源氨基酸损失量“（Vincent  Hess等，1997）。 
        1.1无氮日粮法（proteinfree diet ） 
                       
         无氮日粮法是测定饲料氨基酸真消化率最经典的方法，它是由Mitchell在1924建立的。其假定条件是动物采食无氮日粮后，进入食糜或粪中的蛋白质、氨基酸即为内源性的，并且在日粮组成不同的条件下，动物内源性氨基酸的排泄量和氨基酸组成是相同或相似。然而事实是并非如此。low(1979)指出,饲喂无氮日粮可能改变动物的代谢而影响内源氮的损失量。Ozimek等（1985）发现，动物采食无氮日粮后，胰腺分泌的消化酶,如胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶减少，肠道分泌的蛋白总量也减少。研究还发现，无氮日粮不仅改变了动物的内源氮损失量，也使内源氨基酸的组成发生了变化，大大增加了了内源脯氨酸和甘氨酸的损失（De Lange，1989)。这是因为，动物采食无氮日粮时，由于动物体维持正常生命活动和生产活动所需的蛋白质无法从无氮日粮中摄取，于是动用肌肉组织释放大量氨基酸，其中以谷氨酰胺最多，谷氨酰胺又代谢成谷氨酸、脯氨酸等，因此猪采食无氮日粮时，食糜中脯氨酸含量增加，而且随着无氮日粮中纤维素水平的升高，回肠末端食糜中甘氨酸和脯氨酸的量显著增加（de   Lange 等，1989；Leterme等，1992；  Mariscal-Landin等，1995），这是由于日粮中的纤维素刺激了唾液和胆汁分泌的结果（Low,1982），唾液和胆汁分泌的糖蛋白中含有较多的甘氨酸和脯氨酸。

                       
        无氮日粮法简便，易操作，成本低，至尽仍在广泛采用。但用该方法测定内源氮时，动物处于非正常生理状态（low,1980），影响动物体蛋白质的正常的代谢(Millward等，1976)，减少含氮物质向消化道的分泌。Butts等（1992）和Donkoh等（1995）研究表明，无氮日粮因缺乏蛋白质类对消化道的刺激，会低估回肠末端内源性氨基酸的含量。此外，日粮成分中的纤维、抗营养因子等可能提高内源性氨基酸的排泄量（Ikegami,1990;Liener和Kakade,1980），而无氮日粮中因缺乏这类物质的刺激，也会导致测定结果偏低。因此，一般认为无氮日粮低估了猪的内源性氨基酸的排泄量（Butts等，1993；  Donkoh和Moughan,1999）。 
         1.2回归外延法 
                       
        为了克服无氮日粮的缺陷，Carlson等（1970）发明了一种回归外延法，用以估测内源性氨基酸的排泄量。其方法是，测定猪饲喂不同蛋白质水平的日粮时粪中或食糜中的蛋白质或氨基酸量，然后用数理统计的方法，外推出日粮蛋白质水平为零时，粪或食糜中蛋白质或氨基酸的量，即为内源性蛋白质或氨基酸的损失量。Fan等（1995）认为该法对内源氮的损失的估计比无氮日粮法有更高的准确性，因为这种方法考虑了不同品质的蛋白质和抗营养因子等对内源氮和氨基酸排出的影响（souffrant,1991;Fan等，1995）。然而，大量的研究表明，回归外延法与无氮日粮法并没有什么差异（Taverner等,1981;Furuya 和 Kaji,1989;Donkoh等,1995）。该方法虽然考虑了日粮蛋白质含量对内源性氨基酸排泄量的影响，但与无氮日粮法一样，在计算饲料氨基酸真消化率时，仍然存在不同的饲料都扣除同量内源性氨基酸。而且，Souffrant(1991)研究发现，蛋白质采食量与内源性氨基酸排泄量不存在线性关系，而且饲料蛋白水平的增加总是与其它营养物质成分的改变相联系，因此，影响了对结果进行准确的估测。

          1.3完全可消化蛋白源法或静脉灌注平衡氨基酸法 
                       
        为避免无氮日粮对动物造成的非生理状态对测定造成的不利影响，Leibholz(1982)给生长猪饲喂以完全消化的酪蛋白为唯一氮源的日粮估测内源氨基酸排泄量，结果发现，内源氮的排泄量与无氮日粮的测定值没有显著差异（分别为3.4和3.0g/kgDMI）。然而Fuller和Cadenhead(1991)向无氮日粮中添加酪氨酸和合成氨基酸，结果表明，采食酪氨酸和合成氨基酸日粮的猪的内源氮的损失低于采食无氮日粮猪的内源氮损失（分别为4.3和5.8g/d）。后者的研究结果与Lange等（1989）的研究结果一致。这说明，处于正氮平衡状态下猪的内源性氨基酸的损失量稍低于处于负氮平衡下内源氨基酸的损失量。Leterme等（1994）比较了无氮日粮、可消化酪蛋白法和静脉灌注平衡氨基酸法对回肠内氨基酸损失的影响，结果表明，静脉灌注平衡氨基酸法测得的内源氨基酸损失（除脯氨酸、胱氨酸和蛋氨酸外）与无氮日粮法没有明显差异。因为氨基酸并不能起到蛋白质或多肽刺激消化酶分泌的作用，但由于静脉灌注氨基酸可以消除负氮平衡导致的体组织分解，因而可减少尿氮损失。

                       
        该法前提条件是，酪氨酸或平衡氨基酸在消化道内被完全吸收。而事实上，日粮中的粗纤维水平（Bergner等，1994）和抗营养因子含量（Huisman等，1992）都可能影响其吸收，而只有当酪氨酸或平衡氨基酸的的真消化率经试验证明达到100%时，该方法在实际应用中才能得到可靠的结果。

         2.同位素标记法 
         同位素标记技术是直接测定猪采食含蛋白质日粮时内源氮损失的一种方法。一般用15N 或13C对饲料蛋白或动物体氨基酸库进行标记。 
         2.115N同位素标记法 
                       
         15N同位素标记技术可区分内源氮和非消化氮，而且可用于测定日粮成分变化对内源氮和氨基酸损失的影响，被认为是直接测定猪采食含蛋白质日粮时内源氮损失的一种最有效的方法（Souffrant等，1986）。15N同位素标记技术可通过两种途径进行，一是对饲料蛋白质进行标记（Leterme等，1994；Roos等，1994），二是对动物的氨基酸库（de Lange,1989;Huisman等，1992；Schulze等，1994）即内源性氨基酸进行标记，其中以后者最为常用。此法的根本假定是，当15N在体内各部位达到恒态后，回肠末端内源氮中15N同血浆游离AA（血液氮前体池三氯乙酸溶解物）中15N相同。其基本操作为，持续往动物血液中灌注标记的氨基酸，标记内源氮的前体池，当15N标记物在血液氮前体池三氯乙酸（TCA）溶解物中达到稳定后，根据血液氮前体池三氯乙酸（TCA）溶解物中15N富集度同回肠末端食糜中15N之比即可推算出食糜中内源氮占总氮的比例（de  Lang,1989;Huisman等，1992；Schulze等，1994）。 
       在应用15N稀释技术时，被标记的含氮物的选择、15N 标记物在血液中的稳态的确定（15N富集度稳态的判断）和内源氮前体库的选择（Moughan等，1992）都直接影响内源氮估计的准确性。由于亮氨酸是很稳定的氨基酸，除蛋白质合成外没有其他重要的代谢功能（Grala等，1998），因此，15N-亮氨酸被普遍选作标记物；而回肠食糜内源15N的富集度与血清三氯乙酸（TCA）可溶部分中15N的富集度相似（Grala等，1998），因此可以以15N在血清TCA可溶部分中的稳定状态作为15N标记物的稳定态。但肠道氨基酸的再循环是十分迅速的，在血清总氮TCA可溶部分中，15N的富集存在昼夜变化。因此，人们对血清TCA可溶部分是否存在着15N富集的稳定态存在着质疑。然而，Alpers(1972)研究表明，被吸收氨基酸可不进入血液，而直接被肠细胞用于蛋白质的合成，所以，血清三氯乙酸可溶部分中15N的富集度可能低估了内源氨基酸的排出量。

                       
        除此之外，用15N测定氨基酸的真消化率还存在很多问题。如，该法仅能直接测出一种氨基酸的消化率，而其他氨基酸的消化率是在假设其它氨基酸与此氨基酸的内源损失之间存在恒定的关系式而估计出来的，这一方法的可行性尚有疑问（Lien等,1993）；该方法的另一个问题是前体库中并非所有的含氮物是完全标记的（de Leng等,1992）。且该法费用昂贵，在实际应用中受到很大的限制。 
           1. 213C 标记法 
                       
        13C标记法的原理是利用植物中自然富集的13C作为标记。已知大气中二氧化碳约含有1.1%同位素13C和98.9%的12C。在光合作用时，植物是排斥13C的(O`Leary,1981)。但植物通过二羧途径（C4途径）固定二氧化碳时，比通过Calvin（C3途径）循环对13C的排斥程度低（Minson等，1975）。玉米、高粱、甘蔗是C4植物，而小麦、大麦和大豆是C3植物。而动物在利用日粮氨基酸合成体蛋白时并不排斥13C（Minson,1975）。因此，用13C富集程度不同的日粮饲喂动物时，若能相应产生不同程度的标记，且在多种组织的标记率不同，利用同位素比率质谱仪就可用于测定13C的自然富集，从而对内源氮和氨基酸损失进行估计，测定不同日粮中的蛋白质和氨基酸的真消化率（Arentson等,1995）。Arentson等（1995）用13C作为标记，用小肠氨基酸组分13C的富集程度作为内源蛋白质标记的指数把回肠蛋白质区分为内源和未消化蛋白质两部分，测定了不同日粮的真氨基酸消化率。结果表明，13C标记方法可用于测定氨基酸的内源损失，但这种方法仍有与15N-相同的缺点，即标记物再循环，动物氮库的标记方法及代表内源氮分泌的组织选择问题，但因为13C在饲料中是自然富集的，并不需要另行标记，因此13C方法比标记15N的费用要低得多，但仍需用昂贵的同位素比质谱计。

         2. 高精氨酸法 
          高精氨酸技术是由Hagemeister 和Erbesdobler(1985)首先提出的。原理是在一定条件下，通过甲基异脲（Methylisourea）与日粮赖氨酸发生胍基化反应将日粮赖氨酸转化为高精氨酸。当高精氨酸被动物体吸收后，在肝脏中精氨酸酶的作用下，又被重新转变为赖氨酸，同时释放出尿素。高精氨酸被机体吸收后不能用于蛋白质合成（不构成内源氮），因此吸收后的高精氨酸不会重新出现在肠道中，回肠食糜中存在的高精氨酸应该全部是外源性的，即为饲料中未被消化道吸收的外源蛋白质，其数量代表了未被消化的外源蛋白质的量（Souffrant,1991;Schmitz等,1991）。高精氨酸技术应用的前提条件有：（1）待测日粮蛋白中赖氨酸的胍基化反应必须完全（至少保证日粮中绝大数的赖氨酸都能转化为高精氨酸）；（2）胍基化反应不会影响动物对日粮蛋白质的消化吸收；（3）高精氨酸不在肠道中水解为赖氨酸和尿素；（4）高精氨酸同其它氨基酸一样进行吸收代谢；（5）高精氨酸不会重新出现在肠道中；（6）血液或肠道内的高精氨酸不会影响内源氮的损失（Drescher等,1994;Marty等,1994）。

          大量的研究证明，高精氨酸技术可用于直接测定内源赖氨酸和日粮赖氨酸真消化率（Rutherfurd 和Moughan,1990;Schmitz 等，1991；Marty等,1994）。但用此方法测定热损坏蛋白质的赖氨酸真消化率和内源赖氨酸损失时，须给予特别注意。因为只有当高精氨酸在待测饲料蛋白质中均匀分布时，样品才具有代表性，否则影响测定结果（Schulze 等，1994）。如果饲料蛋白质中的赖氨酸侧链被封闭，特别是经Maillard反应后被封闭，赖氨酸的侧链就不能与甲基异脲反应而转化高精氨酸，造成饲料蛋白质标记不完全，不具有代表性。在这种情况下，待测饲料高精氨酸的消化率只代表了未被热损害的部分蛋白质，而非整个待测饲料蛋白质的消化率，从而导致对内源赖氨酸损失及待测饲料赖氨酸真消化率的估测不准确（Schulze等，1994）。

                       
       由于日粮赖氨酸胍基化反应的充分与否随日粮蛋白质来源的不同而有所差异，这就限制了该法的应用（Maga,1981;Rutherfurd and Moughan,1990;de Vrese 等,1994），所以该方法更适用于日粮的蛋白质来源只有一种时的情况。而在实际生产中，日粮蛋白质是多种蛋白源共同组成，所以，能否利用其测定内源氮氨基酸还有待于确定。Nyachoti等（1997）用高精氨酸技术测定不同蛋白质原料对内源赖氨酸排出量的影响时，得出的结果变化范围为586~1429mg/kgDMI。高精氨酸技术可直接测定的内源赖氨酸的损失情况和日粮赖氨酸的真消化率，而其它氨基酸的内源损失和真消化率则是由假设其它氨基酸与赖氨酸的内源损失之间存在恒定的关系式而估计出来的（de Lange等,1990;Marty等,1994）。因此，应用高精氨酸技术估计赖氨酸之外的其它氨基酸的内源损失和真消化率的准确性还需进一步探讨。

        4.肽营养超滤技术 
                       
       Moughan等（1990）及Butts（1991）建立了肽营养超滤法。其技术原理和过程如下：给动物饲喂含酶解酪蛋白（Enzyme  hydrolysed casein,EHC）（分子量低于8.25×10-21g）作为唯一蛋白质来源的半纯合日粮，然后收集回肠末端食糜，立即通过离心和超滤等方法，将食糜中的大分子蛋白质（分子量大于1.65×10-20g）与小分子蛋白质（分子量小于1.65×10-21g）迅速分离开来，大分子量蛋白质即为内源性，而小分子量蛋白质是饲粮中未被吸收的部分。事实上，分离出的小分子蛋白质不完全是外源的氨基酸和小肽，还包括一小部分内源的氨基酸和小肽。Morghan和Schutter(1991)报道内源氮损失中小分子的游离氨基酸和小肽大约占１１％，而Butts等（１９９２）和 Marty等（１９９４）报道的数据分别为２１％和９.２％。这说明内源氮损失中游离氨基酸和小肽所占比例变异较大，而这部分可能导致低估实际的内源氨基酸的损失。

                       
         与无氮日粮相比，肽营养超滤法无疑有利较大的改进，避免了由于日粮蛋白质缺乏而导致的消化性分泌减少，对动物采食平衡日粮时的内源氮损失的估计可能更准确。Butts 等（1991）将该方法成功地运用于生长大鼠的内源性氨基酸排泄的测定，测定结果表明，该方法的测定值高于无氮日粮法，而与15N同位素标记法的结果相当。说明该方法在评估动物的内源性氨基酸排泄上有相当的准确性。但是，肽营养技术的一个主要的不足是该方法没有考虑日粮因素（如日粮成分和高水平的抗营养因子等）对内源氮损失的影响。此外，肽营养超滤法存在的一个问题是超滤技术本身的问题，超滤技术不适于定量分离，Letermre等（1994）比较了超滤和凝胶过滤两种分离技术后认为，在分离可溶性组分时两方法有较大的差异，其中以凝胶过滤法效果较好。Donkoh等（１９９５）指出，肽营养超滤技术适用于日粮蛋白质来源为动物性成分（如骨粉）的内源氮损失的估计。

         3. 氨基糖测定法 
                       
         Fuller等（1991）提出可以用氨基糖作为估测回肠末端内源氮损失的指示物，氨基糖是粘蛋白的组成成分。Seve等（1994）对内源氮及氨基糖随日粮蛋白质水平和粗纤维含量的变化规律进行的研究发现，氨基葡萄糖与氨基半乳糖的比值不受日粮成分变化的影响，为2.1~2.3，接近于粘蛋白中的比例，这表明到达回肠末端的氨基糖是一个较为稳定的指标。但Seve等（1994）的试验还表明，随日粮纤维水平的提高，氨基糖未能表现出与内源氮相似的变化规律。据此，Seve等（1994）指出，氨基糖虽可作为内源氮的指示物，但它反映的更可能是粘蛋白的分泌情况，而非真正的内源氨基酸损失，由此可见，该方法的实际应用还需对氨基糖的分泌和影响因素以及与内源氮分泌规律间的联系作进一步研究。

           4. 体内、体外结合测定法 
                       
         Boizen和Fernandez提出了这一方法，体外测定部分模拟体内的消化过程，用胃蛋白酶、胰酶溶液对饲料样品进行处理，根据饲料与消化残余物间的差值求出蛋白质的体外消化率，再用体内消化法测定出饲料的表观回肠末端蛋白质消化率，则这两者的差值就是内源氮的损失部分（Boizen和Fernandez，1994）。其与体外测定部分中的体外未降解干物质间的回归关系为：

                       EPL=13.2=0.66×UDM (r2=0.61) 
              （EPL 内源氮损失 （g/kgDM） UDM 体外未降解干物质（g/kgDM）） 
                       
        该方法简便、省时、省力。但尚存在一些疑问，如，体外未降解干物质是否为内源蛋白质、氨基酸的适宜指示物；哪些因素影响试验的结果等。这一方法还需做大量的验证工作，如能验证则会有广阔的应用前景。

           结语 
                       
         随着内源氨基酸的测定方法的不断改进，内源氮和氨基酸测定的准确性也大大提高了。但迄今为止，直接测定内源氨基酸的方法尚存在技术上或经济上的困难，因此，这一领域还有待于进一步深入研究，以便找出一种经济、简便、实用的测定内源氨基酸的方法，更准确地评价蛋白质的营养价值，从而为饲料配方提供信息，也为进一步提高饲料蛋白质的利用效率提供理论依据。