1 主题内容与适用范围
本标准规定了饲料中维生素B2测定方法。
本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料中维生素B2的测定。待测液中维生素B2检测浓度为0.05～0.2μg／mL。
2 引用标准
GB 6682 实验室用水规格
3 方法原理
维生素B2（即核黄素C
17H20N1O6）在440nm紫外光激发下产生绿色荧光，在一定浓度范围内其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品核黄素的含量。
4 试剂和溶液
除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。
4.1 盐酸溶液，0.1mol／L：将8.5mL盐酸（GB 622）用水稀释至1000mL。
4.2 盐酸溶液，1mol／L。
4.3 氢氧化钠（GB 629）溶液，1mol／L。
4.4 冰乙酸（GB 676）。
4.5 冰乙酸溶液，0.02mol／L：将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL。
4.6 高锰酸钾（GB 643）溶液，40g／L。
4.7 过氧化氢（HG 3─1082）溶液，100mL／L。现用现配。
4.8 核酸素标准溶液
4.8.1 核黄素贮备液
：核黄素（中国药典参照标准），于五氧化二磷干燥器中干燥24h，称取0.0500g，溶解于0.02mol／L
乙酸溶液（4.5）中，在蒸汽浴上恒速搅动直至溶解，冷却后稀释至500mL。盛入棕色瓶滴加甲苯覆盖，低温（4℃）保存。该溶液每毫升含0.1mg核黄素。
4.8.2
核黄素贮备液Ⅱ：取核黄素贮备液Ⅰ（4.8.1）10mL用0.02mol／L乙酸溶液稀释至100mL，盛于棕色瓶中滴加甲苯覆盖，低温（4℃）保存。该溶液每毫升中含10μg核黄素。
4.8.3 核黄素标准工作液：取核黄素贮备液Ⅱ（4.8. 2） 10mL，用水稀释至
100mL。现用现配。该溶液每毫升中含1μg核黄素。
4.9 荧光素标准溶液
4.9.1 荧光素贮备液：称取荧光素（Q／HG
22─786）0.0500g，用水稀释至1000mL，盛于棕色瓶中，低温（4℃）保存。该溶液每毫升中含50μg荧光素。
4.9.2
荧光素标准工作液：取荧光素贮备液（4.9.1）1mL，用水定容至1000mL，盛入棕色瓶中，低温保存。该溶液每毫升中含0.05μg荧光素。
4.10 溴钾酚绿pH指示剂：取溴钾酚绿（HGB
3386）0.1g，加氢氧化钠溶液（0.05mol／L）2.8mL使之溶解，再加水稀释至200mL。变色范围ph4.6～5.2。
4.11 连二亚硫酸钠（Na2S2O4）（Q／HG 2─001），防止吸潮。
5 仪器、设备
5.1 荧光分光光度计。
5.2 分析天平：感量0.0001g。
5.3 电热恒温水浴。
5.4 具塞玻璃刻度试管，15mL。
6 试样的制备
采集具有代表性的样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，通过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。
7 分析步骤
7.1称样：单一饲料、配合饲料、浓缩饲料称取1～2g，精确至0.001g。维生素预混料称取0.25～0.50g，精确至0.0001g，将试样置于100mL容量瓶中。
7.2
样液的制备：向盛样品的容量瓶中加65mL盐酸溶液（4.1），于沸水浴中加热30min，开始加热5～10min时常摇动容量瓶，以防样品结块。或于121～123℃
15磅高压釜中加热30min。冷却至室温后，用氢氧化钠溶液（4.3）调节pH至6.0～6.5，然后立即加稀盐酸溶液（4.2）使pH值约为4.5（溴甲酚绿指示剂变为草绿色）。用水稀释至刻度。通过中速无灰滤纸过滤，弃去最初5～10mL溶液，收集滤液于100mL
锥形瓶中。取整份清液，滴加稀盐酸检查蛋白质如有沉淀生成，继续加氢氧化钠溶液，剧烈振摇，使之沉淀完全稀释到测量体积。对高含量样品，取整分的澄清液，用水稀释至一定体积使含核黄素约为0.1μg／mL（以下操作避免紫外光照射）。
7.3
杂质氧化：于a、b、c三支15mL刻度试管（5.4）中各吸入样液（7.2）10mL，同时做平行，向试管a、b、c中各加入1mL蒸馏水，向试管b中加入1mL核黄素工作液（4.8.3）。然后各加入冰乙酸（4.4）1mL，旋摇混匀后逐个加高锰酸钾溶液（4.6）0.5mL，旋摇混匀，静置2min，再逐个加入过氧化氢溶液（4.7）0.5mL旋摇，使高锰酸钾颜色在10s内消退。加盖摇动，使试管中的气体逸尽。
7.4
测定：用荧光素溶液（4.9.2）调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。调整激发波长440nm，发射波长525nm，测定试管a、b的荥光强度，样液在仪器中受激发光照射不超过10s。在试管c中加入20mg连二亚硫酸钠，摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定卒荧光强度作为空白。若溶液出现浑浊，不能读数。
8 分析结果的计算和表述
8.1 计算方法和公式
核黄素（维生素B2）含量以mg／kg（或g／kg）表示，按下式计算：
核黄素（VB2mg／kg）＝〔（A－C）／（B－A）〕×（M／m）×（V／V1）×R
式中：A──
试管a（样液加水）的荧光强度；
B──
试管b（样液加标样）的荧光强度；
z ──
试管c（样液加连二亚硫酸钠）的荧光强度；
m──
加入核黄素标样的量，μg；
V──
样液的初始体积，mL；
V1──
测定时分取样液的体积，mL；
m──
试样质量，g。
R──
稀释倍数。
A-C／B-A值应在0.66～1.5，否则需调整样液的浓度。
8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。
9 重复性
同一分析者对同一试样同时或快速连续进行两次测定，所得结果之间的差值：
在核黄素含量小于或等于5.0mg／kg时，不得超过平均值的15％。
在核黄素含量大于5.0mg／kg时，不得超过平均值的10％。
