满江红（MJH）属浮水草本，药用全草，其性寒、味辛。具有发汗利尿、祛风利湿、清热解毒等功效，主要用于感冒咳嗽、风寒疼痛、丹毒、痛风病、红崩白带、瘫痪、烫火伤等。从营养成分分析，粗蛋白占烘干重16-25%左右，粗纤维占烘干重9.7%，粗脂肪占烘干重2.2%。为了使MJH能够得到有效合理利用，研究确定在肉鸡生产中最佳饲料配比及对肠道病防治效果，我们进行了如下饲喂试验，从侧面揭示了MJH的作用机理和使用准则。
一、MJH对肉鸡的饲喂试验
1、材料和方法：
1.1试验地点：山东省农科院家禽研究所动物实验场。
1.2、试验时间：
第一批：2003年7月2日—8月13日；
第二批：2004年2月16日—3月30日；
第三批：2004年5月8日—6月20日。
1.3、材料与方法
A、试验动物：
第一批：AA肉公鸡60只，逐只带翅号，随机分为2组，每组30只；
第二批：AA肉公鸡180只，逐只带翅号，随机分为6组，每组30只；
第三批：AA肉公鸡180只，逐只带翅号，随机分为3组，每组设2个重复，每个重复30只。
试验期为6周，基础日粮为鲁禽牌饲料。
B、试验材料：
①MJH：满江红干粉（40目）；
②MJH复合制剂：满江红干粉（40目）+芽孢杆菌制剂；（芽孢含量为108CFU/gMJH复合制剂）
1.4、试验方案：（见表1）
表1：MJH肉鸡饲喂试验方案
批次组别饲喂方法
|
І1-1基础日粮
1-2基础日粮+2%MJH
П2-1基础日粮
2-2基础日粮+0.5%MJH
2-3基础日粮+1%MJH
2-4基础日粮+2%MJH
2-5基础日粮+5%MJH
2-6基础日粮+10%MJH Ш3-1基础日粮
3-2基础日粮+2%MJH
3-3基础日粮+2%MJH复合剂
|
1.5试验日粮：采用玉米-豆粕型基础日粮，配方及营养水平见表2
表2：基础日粮的配方及营养水平
基础日粮
|
0-3周龄
|
4-6周龄
|
玉米
|
62
|
64.4
|
豆粕（%0
|
32.5
|
28.6
|
油（%）
|
0.5
|
2.0
|
预混料（%）
|
5.0
|
5.0
|
代谢能（Mcal/kg）
|
2.96
|
3.07
|
粗蛋白（%）
|
21.0
|
19.5
|
钙（%）
|
0.86
|
0.85
|
有效磷（%）
|
0.42
|
0.41
|
备注：预混料成分包括复合维生素、复合微量元素、氨基酸等。
1.6饲养管理；统一用粉料进行网上饲养，人工控温，自然湿度，自然光照和人工光照相结合，人工定时投料，自由采食和饮水，常规免役。
1.7测定指标和方法
A.体重：逐只1日龄、21日龄和试验期末体重。
B.饲料消耗：采用“清箱底法”每7天以重复组为单位进行结料。
1.8数据处理：试验数据用SAS软件进行统计分析。
2.结果与分析
①第一批饲喂试验结果：见表3
组别
|
始重
|
称重结果（克）
3周龄
|
6周龄
|
死亡数（只）
|
死淘率（%）
|
1-1
|
40.32±2.8
|
675.86±18.24
|
1838.41±128.33
|
10
|
33
|
1-2
|
39.98+4.1
|
689.52+21.16
|
1976.25+140.12
|
3
|
10
|
表3：1批饲喂结果
在试验过程中，在28天发现有大肠杆菌病，一直坚持不用药治疗，结果42日龄时对照组死亡10只，试验组死亡3只。本次试验由于爆发大肠杆菌病，对体重影响的结果没有多大参考价值，但可以看出，满江红对肠道疾病有一定的防治作用。
②第二批试验结果：见表4和表5
组别
|
始重
|
称重结果（克）
3周龄
|
6周龄
|
死亡数（只）
|
死淘率（%）
|
2-1
|
40.1±3.6
|
506.3±31.5
|
1879.4±105.2
|
8
|
26
|
2-2
|
41.3±4.1
|
509.8±32.1
|
1932.3±121.3
|
7
|
23
|
2-3
|
39.6±3.7
|
521.6±33.7
|
1980.8±113.1
|
4
|
13
|
2-4
|
41.5±3.0
|
532.4±36.2
|
2022.3±104.2
|
3
|
10
|
2-5
|
42.3±2.9
|
489.6±35.8
|
1745.2±102.3
|
2
|
7
|
2-6
|
39.9±3.4
|
456.1±30.8
|
1712.6±120.1
|
3
|
10
|
表4 Ⅱ批饲喂试验结果
表5 MJH添加量对饲料转化率和肉鸡产量的影响
组别
|
1-21天
|
肉鸡增重（克）
22-42天0-42天
|
采食量
（克）
|
饲料转化率
|
|
2-1
|
466.2±42.1
|
1373.1±113.0
|
1839.3±121.0
|
4065
|
2.21
|
2-2
|
468.5±36.4
|
1422.5±123.3
|
1891.0±115.2
|
4070
|
2.15
|
2-3
|
482.0±35.7
|
1457.6±128.2
|
1939.5±130.5a
|
4048
|
2.08
|
2-4
|
490.9±52.4
|
1489.9±124.2
|
1980.8±118.4a
|
4054
|
2.05
|
2-5
|
447.2±46.3
|
1255.6±142.2
|
1702.9±121.0
|
4126
|
2.42
|
2-6
|
416.5±36.2
|
1256.5±133.2
|
1672.7±126.3
|
4089
|
2.45
|
备注：上标字母a,P<0.05，不标注者P>0.05。
由上表可见，试验组2-3和2-4的全期增重显著高于对照组（P<0.05），其中尤以试验4组最高，分别比对照组提高5.4%和7.6%，试验2组和对照组差异不大，而试验组5、6组明显不如对照组。增重促肉鸡生长，以2%添加为最好，过高浓度的添加可能由于降低了日粮的能量和蛋白水平而妨碍肉鸡的生长。由表5可见，随着满江红添加量的增加，肉鸡的死淘率降低，其中以试验4、5、6组最好，分别比对照组降低了16%、19%和16%。综合以上的结果分析，满江红添加效果以2%为最好。
③第三批饲喂试验结果（见表6和表7）
表6：III批饲喂试验结果
组别
|
始重
|
称重结果（克）
3周龄6周龄
|
死亡数
（只）
|
死淘率
（%）
|
|
3-1
|
41.4±2.7
|
582.3±14.2
|
1892.4±106.9
|
10
|
33
|
3-2
|
40.7±3.2
|
590.4±12.6
|
1963.5±114.3
|
|
|
3-3
|
42.1±4.1
|
645.4±15.6
|
2135.9±128.4
|
3
|
10
|
表7：MJH复合剂的添加量对饲料转化率和肉鸡产量的影响
组别
|
肉鸡增重（克）
1-21天22-42天0-42天
|
采食量
（克）
|
饲料转
化率
|
||
3-1
|
541.0±13.6
|
1310.0±115.6
|
1851.1±112.5
|
4074
|
2.20
|
3-2
|
549.7±15.3
|
1373.1±120.4
|
1922.8±122.4a
|
4065
|
2.11
|
3-3
|
603.3±14.4
|
1490.5±133.1
|
2093.8±131.1A
|
4106
|
1.96
|
备注：上标字母a表示P<0.05，不标注者P<0.01。
根据第二次试验结果，考虑到在以后大面积的应用成本，又设计了第三次饲喂试验，把满江红和微生态制剂复合使用，以满江红和芽孢杆菌制剂相结合，制成复合制剂（109CFU/g）。由表7可以看出，两个试验组增重均高于对照组，3-2组显著高于对照组（P<0.05），3-3组显著高于2组（P<0.05），3-3组极显著高于对照组（P<0.01），各组全期总采食量差异不显著，料重比明显低于对照组，分别比对照组降低4.5%和10.9%，说明满江红和芽孢杆菌复合制剂对肉鸡生长有很好地促进作用。
3．规模饲喂试验
①时间：2004.08.10—2004.09.22
②地点：康大集团第三养鸡场
③品种与数量：1日龄AA鸡3万余只。
④日粮：康大饲料公司各期全价颗粒饲料。
⑤试验设计：试验分三组，1、2组为试验组。3组为对照组，试验组日粮中添加满江红粉。
⑥试验结果（见表8）
表8：MJH饲喂试验结果
组别
|
存栏数（只）
|
死淘数（只）
|
死淘率（%）
|
平均增重（Kg）
|
平均耗料（Kg）
|
料肉比
|
1
|
11074
|
121
|
1.09
|
2.08
|
4.22
|
2.09
|
2
|
11108
|
132
|
1.18
|
2.11
|
4.12
|
1.95
|
3
|
10986
|
414
|
3.77
|
1.89
|
4.12
|
2.18
|
⑦结果分析
通过以上试验可以看出，在日粮中添加2%满江红死淘率降低2.6%，料肉比下降8%，经济效益显著提高。
4．饲喂试验结果讨论
为寻求促进动物生长的抗生素替代品，发展绿色养殖业，国内外研究者进行了大量的研究和探索，本研究以无毒无害无残留的蕨类植物-满江红为材料添加于动物饲料中，饲养肉鸡进行了有益的探索，取得了满意的结果。满江红不仅能促进肉鸡的生长，而且对肠道疾病有一定的防治作用，为了进一步探索其作用机理，我们又进行了动物体内和体外试验来研究。二、MJH的作用机理研究
二、MJH的作用机理研究
从传统的中药文献中分析，并没有发现满江红对肠道疾病防治作用的记载，但多年来民间流传的使用方法中，满江红确实可以被用于防治畜禽的肠道疾病，同时，中科院北京植物所和浙江农科院所完成的有关畜禽的饲喂试验结果显示，满江红在饲料中添加量为1-10%时，其防治肠道疾病的效果均较为显著，本试验的研究结果也进一步证明了这个结论。但有关满江红的作用机理却未见文献报道，为了使此类绿色养殖资源能够得到合理有效的应用，我们进一步进行体内外试验，分析了满江红对肠道有益菌群和大肠菌群生长繁殖的影响，通过对试验肉鸡肠道的微生态环境的分析结果，揭示了满江红的作用机理的一个重要方面。
2．1体外试验
2．1．1材料和方法
①仪器与设备
VSF——1300A超净工作台（日本医化器械制造所）
YXQG02型电热式蒸汽消毒器（山东新华医疗器械厂）
303型电热培养箱（黄骅市卸甲综合电器厂）
420型电热恒温培养箱（山东省潍坊医疗器械厂）
H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东连电子技术开发有限公司）
TDA-8002型水浴锅（黄骅市卸甲综合电器厂）
79-1型磁力加热搅拌器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）
721型分光光度计（上海第三分析仪器厂）
METTLER PM 2500XING电子天平
BBL厌氧罐
XSP-2C生物显微镜
②培养基
i对照培养基
培养乳酸菌和双岐杆菌的对照培养基为改良MRS培养基（配方见表9），培养大肠杆菌的对照培养基为LB液体培养基（配方见表10）
表9：改良MRS培养基组分
组分
|
含量（g/L）
|
组分
|
含量（g/L）
|
胰蛋白胨
|
10
|
磷酸氢二钾
|
2
|
葡萄糖
|
20
|
无水醋酸钠
|
3
|
牛肉浸膏
|
10
|
柠檬酸三铵
|
2
|
酵母浸膏
|
5
|
七水硫酸镁
|
0.2
|
X-Gal
|
0.06
|
吐温-80
|
1ml
|
L-半胱氨酸
|
0.5
|
水或MJH水提液
|
1000ml
|
备注：培养基消后用5NNa0H调至pH6.8；
表10：LB液体培养基组分
组分
|
含量（g/L）
|
组分
|
含量（g/L）
|
胰蛋白胨
|
10
|
氯化钠
|
10
|
酵母提取物
|
5
|
蒸馏水
|
1000ml
|
备注：培养基消后用5NNa0H调至pH7.0；
ii鉴别培养基
双歧杆菌和乳酸菌的鉴别培养基为改良MRS固体培养基（1.5%琼脂，配方见表9），大肠杆菌的鉴别培养基为EMB固体培养基（配方见表11）
表11：EMB固体培养基组分
组分
|
含量（g/L）
|
组分
|
含量（g/L）
|
蛋白胨
|
10
|
磷酸氢二钾
|
2
|
乳糖
|
10
|
美篮
|
0.065
|
伊红-Y
|
0.4
|
蒸馏水
|
1000ml
|
琼脂
|
13
|
|
|
备注：培养基消后用5NNa0H调至pH7.1-7.3；
iii增殖液体培养基
有益菌增殖培养液采用改良MRS（对照）和MJH-MRS（简称MM）培养液，大肠杆菌的增殖培养液采用LB（对照）和MJH-LB（简称ML）培养液（见表12）：
表12：增殖培养液组成
乳酸菌和双歧杆菌增殖培养液
MM-1MM-2MM-5MM-10
|
大肠杆菌增殖培养液
ML-1ML-2ML-5ML-10
|
MRS配方中的蒸馏水分别由1%、2%、5%和10%浓度的满江红水提液所替代，其他成分不变。
|
LB配方中的蒸馏水分别由1%、2%、5%和10%浓度的满江红水提液所替代，其他成分不变。
|
③MJH水提液的制备
称取50g满江红粉末加到500ml蒸馏水中，放到磁力加热搅拌器上搅拌120min-180min，配制10%的满江红稀释液。用12层纱布过滤3次，滤出浓度为10%的稀释液。然后取适量分别稀释成5%、2%、1%的稀释液。
④增殖培养方法：
i大肠杆菌增殖培养：
试管斜面菌种，接种环1环至100ml培养液（250ml三角瓶），37℃摇床震荡培养（180rpm）12h。
ii有益菌增殖培养:
乳酸菌或双歧杆菌的液体培养菌种，分别接种1ml至100ml培养液中（100ml厌氧培养瓶），静止厌氧培养48h。
⑤计数方法：采用平板计数法。
有益菌的计数：无菌操作条件下，用无菌生理盐水将样品稀释至一定稀释度，取100ul，倾注MRS平板，并置于厌罐中，37℃恒温培养48—72h，菌落计数。乳酸杆菌菌落为白色或浅蓝色，双歧杆菌菌落为蓝色。
大肠杆菌的计数：无菌操作条件下，用无菌生理盐水将样品稀释至一定稀释度，100ul涂布EMB平板，每个样品涂布3个平板，37℃恒温培养24h，选择具有金属光泽的紫黑色菌落计数。
⑥试验菌种
试验用大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌由山东省科学院生物所提供，从鸡肠道分离纯化所得。
2．1．2结果与分析
①满江红对大肠杆菌和体外抑菌试验（见表13）：
表13：MJH水提液对大肠杆菌生长繁殖的影响
培养
|
稀释度
|
计数结果
|
菌数（108CFU/ml）
|
与对照比较
|
LB
ML-1
ML-2
ML-5
ML-10
|
10-7
10-7
10-7
10-7
10-7
|
114±7
109±11
119±3
120±7
111±10
|
11.4±0.07
10.9±0.11
11.9±0.03
12.0±0.07
11.1±0.10
|
P＞0.05
P＞0.05
P＞0.05
P＞0.05
|
备注：数据处理采用T检验。
结果分析：
从满江红体外抑菌试验的结果可以看出，不同浓度的满江红的水提液菌不能直接抑制大肠杆菌的生长繁殖，从而我们判断满江红中不含有有效的抑菌成分。
②满江红对肠道有益菌群生长繁殖的影响，试验结果见表14：
表14：MJH水提液对乳酸菌和双歧杆菌生长繁殖的影响
培养基
|
稀释度
|
菌数（107CFU/ml）
|
与对照比较
|
||
乳酸菌
|
双歧杆菌
|
乳酸菌
|
双歧杆菌
|
||
改良MRS
MM-1
MM-2
MM-5
MM-10
|
10-6
10-6
10-6
10-6
10-6
|
12.0±0.09
24.6±0.14
23.1±0.03
27.8±0.11
30.1±0.10
|
2.4±0.02
3.7±0.05
3.9±0.03
4.1±0.02
4.3±0.10
|
P＜0.01
P＜0.01
P＜0.01
P＜0.01
|
P＜0.01
P＜0.01
P＜0.01
P＜0.01
|
结果分析：
表14的结果显示，在改良MRS培养液中加入一定浓度的MJH水提液，对乳酸菌和双歧杆菌的生长繁殖均起到有效的促进作用，各试验组的结果与对照相比，均有极显著差异。
2．2体内试验
2．2．1材料与方法：
①检验样品：
样品为第二批肉鸡饲喂试验中对照组和试验2-4组的15日龄和40日龄鸡的新鲜粪便，取样后立即进行有益菌和大肠杆菌的平板计数试验。
②培养基和培养方法
乳酸菌和双歧杆菌：改良MRS固体培养基（配方见表9），倾注平板法，厌氧罐中37℃培养72h；
大肠杆菌：EMB固体培养基（配方见表11），平板涂布法，37℃培养48h。
2．2．2结果与分析
①肠道有益菌和大肠杆菌的检测结果（见表15）：
表15：鸡粪中乳酸菌和双歧杆菌的检测结果
样品来源
|
菌数（log10n.CFU/g样品）
|
|||
日龄
|
组别
|
乳酸菌
|
双歧杆菌
|
大肠杆菌
|
15
40
|
2 –1
2 –4
2 –1
2–4
|
8.26±0.07
8.96±0.04A
8.33±0.08
9.03±0.03A
|
7.45±0.07
8.23±0.02A
7.31±0.05
8.17±0.07A
|
6. 32±0.03
5.18±0.05A
6.55±0.02
5.21±0.07A
|
备注：上标字母A表示与对照相比，P＜0.01
②结果分析：
表15的结果表明，15日龄和40日龄，试验组鸡群肠道内的有益菌的数量明显增加，与对照组相比差异极显著（P<0.01）。而随着日龄增加肠道内益生菌的数量增加不明显，无显著差异性（P＞0.05）。同时，大肠杆菌的数量明显下降，数据分析结果显示，试验组与对照相比，具有极显著差异。此结果为满江红对畜禽肠道病的防治作用机理提供了有利的证据。
三、MJH的应用推广前景
满江红是一类与固氮篮藻共生的蕨类植物，它具有较高的蛋白质含量外，一些微量元素的含量（铁和锰）也比一般谷物高几倍甚至几十倍，从营养的角度分析，它是一类较好的饮料原料，能促进畜禽的生长，提高产品的生产量。同时，满江红在传统家禽饲养中，还常被用于防治畜禽的肠道疾病。但是，以前的相关研究试验和传统家养的养殖模式同现代畜禽的养殖均有较大的区别，满江红是否能在现代养殖中发挥其作用，以及它是否有足够的来源，服务于畜牧养殖业，这些问题都直接关系到满江红在畜牧业的开发应用潜力，这些也是本次研究解决的重点所在。
由试验结果显示：
①满江红以一定的比例进入饲料配方后，能够促进畜禽的生长；
②畜禽被持续饲喂大于1%MJH含量饲料后，可有效的改善肠道内的微生态环境，提高肠道有益菌，乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，从而提高了饲养动物的免疫能力，有效的防治了各种肠道疾病的发生。其作用机理类似于益生元（Prebiotics）的功能，如果与芽孢类微生态制剂合用效果更佳；
③由于满江红与固氮篮藻共生，其生长要求简单，培养成本低，大田养殖每亩水面每年可生产满江红达10000斤以上，产量非常可观，可以为绿色养殖业提供足够的饲料来源；
④本研究结果表明，满江红不含直接抑菌的药物成分，它应用于养殖业，可降低畜禽产品的药物残留，有助于提高产品质量，利于畜牧业的发展。
因此，根据试验结果，我们认为满江红非常适于畜禽类的喂养，是一类优良的饲料原料，它为绿色养殖业提供了一类新的饲料来源，在现代畜牧养殖业中具有很大的应用潜力。
