胰酶水解酪蛋白法生产小肽制品

目前，小肽营养已成为蛋白质营养理论研究的焦点之一。但现在进行小肽理论研究的难点是缺乏合适的肽制品，以及合理有效的鉴定肽制品的方法。为解决这一问题，本试验利用胰酶水解酪蛋白法生产小肽，并对产品质量进行初步鉴定。

l生产原料

酪蛋白：为试剂级干酪素，经半自动凯氏定氮仪测定含氮量为13.53％。

胰酶：取自猪的胰脏，通过特殊生物化学方法制备而成，其中包含胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、氨肽酶和按肽酶等。

2生产步骤

2．l酪蛋白溶液配制 酪蛋白原料经粉碎后倒入带夹层的不锈钢反应锅中，加入5％醋酸溶液浸没酪蛋白，浸泡24h以溶解其中的酸可溶性物质，随后将醋酸从包有多层纱布的底部排水管中排出，然后注入去离子水反复浸泡。彻底冲洗残留的醋酸至溶液的pH为中性，添加会离子水使酷蛋白和水的重量比约为1∶20，随后在双层反应锅的夹层中通入热蒸汽，升高锅内水温至80℃，然后打开反应锅内的自动搅拌器，边搅拌边缓慢加入10％ NaOH溶液，调溶液pH为8.0，连续搅拌直至反应锅内的酪蛋白完全溶解。

加热和加碱的目的是：l）杀灭溶液中的细菌，防止在酶解过程中细菌繁殖而降低蛋白质的营养学价值；2）由于酪蛋白通常情况下不溶于水，但可以溶于热碱溶液中，故加入NaOH溶液可以起到助溶作用；3）热和碱作用可使酪蛋白发生变性，蛋白质的空间结构发生改变，肽链间化学键发生断裂，更易于被蛋白酶分解；4）调整酷蛋白溶液的pH，使胰酶可以发挥最大生物活性。

2．2酶解反应 维持反应锅内溶液80℃的温度至少半小时，然后由夹层通入自来水降低锅内溶液温度至 50 ℃，按 1∶30的酶／底物比加入需要量的胰酶，在搅拌器连续搅拌下开始酶解反应，期间调整通入反应锅夹层的蒸汽量使温度维持在50℃。酶解反应过程中，特别是酶解反应前期，由于胰酶的水解作用，酿蛋白不断地被分解生成多肽，多肽继续被分解成为短链的肽，甚至在按肽酶或氨肽酶作用下生成少量游离氨基酸。由于多肽、小肽或氨基酸为两性电解质，等电点多数偏酸性，所以在反应过程中，随生成的肽逐渐增多整个反应体系的pH值会不断降低，为保证胰酶的最大生物活性使反应液的pH维持在8．0，这就需要不断在反应液中加入NaOH稀溶液。自加入胰酶起6h后酶解反应结束。此时，加大蒸汽的通入量使酶解液升温至 80℃维持30min，其作用有二：一是将胰酶灭活以终止酶解反应；二是再次杀灭反应液中杂菌防止在随后的处理过程中细菌增殖。

2．3过滤处理 酶解反应液分别经板框压滤机和微滤压缩机过滤。板框压滤机的滤膜是由两层厚棉纱布强化固定的加厚滤纸，微滤压缩机中采用过滤孔径为0.5μm石英滤芯，二者过滤除去反应液中较大粒度的胰酶制剂颗粒。使用板框压滤机前，先用蒸馏水从过滤液进口通道压入清水，保证除滤清液出口外没有水从其他处漏出，以证明板框压滤机状况良好。使用微滤压缩机前，先将石英滤芯放于5％ NaOH稀溶液中进行清洗，然后用蒸馏水冲净，以保证最好的过滤效果。

2.4脱盐处理 在过滤后的酶解液中加入10％盐酸进行中和，调节酶解液至中性。为了促进酪蛋白溶解，或酶解过程中为维持酶解反应液pH值的稳定，加入了相当量的NaOH，随后被盐酸中和转化成大量的氯化钠，氯化钠占酪蛋白重量比超过了10％，超出了动物所能承受的限量，所以必须在酶解液进行喷雾干燥前采用离子交换树脂进行脱盐处理。本试验采用强酸型聚苯乙烯阳离子交换树酯（ 001×7型）和强碱型聚苯乙烯阴离子交换树酯（201× 7型）装成树脂柱进行脱盐处理。

2．5浓缩、干燥处理 酶解液经脱盐后，经真空浓缩泵进行真空低温浓缩，使溶液中大量的水分在真空低压下蒸发，随后经干燥塔喷雾干燥，最后得到胰酶水解酪蛋白法生产的小肽制品。

3所得小肽制品的质量检验分析

3．l含氮量测定 采用半自动凯氏定氮仪进行氮含量测定，测定结果为含氮13．3472 ％。

3．2氨基氮测定 采用甲醛滴定法。称取约10g小肽制品用蒸馏水溶解，定容至 1000 mL容量瓶中，取10 mL于烧杯中，并加入20 mL蒸馏水，电磁搅拌器搅拌，在pH计指示下用NaOH满定（M＝ 0．05 mmol／mL）至pH 8．2，再加入 10 mL中性甲醛溶液，搅拌1min后重新滴定至溶液pH为9．2。记录第二次摘定消耗的NaOH溶液体积V₁，用蒸馏水作空白进行滴定，记录消耗的NaOH溶液体积V₀。

酪蛋白酶解液中的氨基氮量 N（mmol）＝ M（V₁-V₀），测定结果酪蛋白酶解液中氨基氮N＝M（V₁- V₀）＝ 0．2237（mmol）。

3．3水解度测定 酪蛋白的水解度DH＝（N／W－0．45）／8．2，其中 W为 10mL滴定液中的小肽制品所相对应的酿蛋白量。酿蛋白量W＝W_肽×0．133472÷0.15674＝0．0854，其中W_肽为所滴定溶液中的小肽制品的重量，0．133472为单位重量小肽制品中氮含量，0．15674指单位重量纯酪蛋白中氮含量。

测定结果：酪蛋白的水解度DH（%）＝（N／W－0．45）／8．2 ×1 00＝26．45，平均肽链长度L＝100／26．45＝3．78。

3．4氨基酸含量分析 采用德国安米诺西斯（aminoSys）公司生产 Amimo Acid Analyzer Al00进行氨基酸分析。

总氨基酸分析：取一定重量的小肽制品经水解后进行氨基酸测定，其中碱水解处理法分析色氨酸含量，过甲酸氧化处理法测定脱氨酸，其余氨基酸以6 M Hcl水解采用常规蛋白质水解物的洗脱程序进行分析、测定。将测定样中各氨基酸重量除以样品中氨基酸总重量，得到各氨基酸在总氨基酸中的比例。测定结果见表1。

表1 小肽制品中总氨基酸及游离氨基酸比例

月	总氨基酸比例（%）	FAA占小肽制品比例（%）	FAA占同种氨基酸比例（%）
天冬氨酸	6.941	0.1594	2.3269
苏氨酸	4.057	0.2757	6.8853
丝氨酸	5.443	0.1130	2.1043
谷氨酸	21.243	0.0692	0.3302
甘氨酸	1．889	0．00589	3．1572
丙氨酸	3．013	0．1255	4．2189
缬氨酸	5．895	0．1870	3．214
异亮氨酸	5．114	0．3901	7．7285
亮氨酸	8．939	0．6732	7．6303
酪氨酸	4．791	0．4315	9．1251
苯丙氨酸	4．534	0．6042	13．5037
赖氨酸	6．871	0．5643	8．3207
组氨酸	2．675	0．2621	9．9259
精氨酸	2．523	0．5307	21．3121
脯氨酸	12．226	0．0452	0．3748
蛋氨酸	2．421	0．1916	8．0202
胱氨酸	0．434	0．2054	47．9274
色氨酸	0．990	0．1345	13．7679

3．5含水量测定 称取约2g 小肽制品，放入预先经105℃高温恒重的培养皿中，在烘箱中继续加热至小肽制品成恒重后，计算肽制品的含水量。计算公式：H_样品=（W_样重一W_烘干重）／w_样重，测定结果：H_样品=5．634％。

3．6寡肽含量测定 称取约5g小肽制品，溶于盛有 500 mL蒸馏水的 1000 mL烧杯中，将烧杯与中空纤维超滤器连接，超滤器的原液输入管和浓缩液输出管均在烧杯中构成一个液体循环体系，调节蠕动泵的转速使超滤器中空纤维柱的工作压力保持在0．l－0．2 MPa，蠕动泵将肽溶液压至中空纤维柱中，中空纤维柱的孔径大小允许分子量小于1000 Da的寡肽分子通过，寡肽小分子在压力下可通过往壁孔径形成超滤液流出，分子量大于 11 Da的大肽不能通过纤维柱孔径，只能顺纤维柱柱芯流动，最后以浓缩液形式返流回烧杯内，经过蠕动泵的连续转动，烧杯中的肽原液不断通过中空纤维柱的超滤作用，使原液最后被分为浓缩液（溶质为分子量大于1000 Da的大肽）和超滤液（溶质为分子量小于 1000 Da的寡肽和游离氨基酸的混合物）。先将旋转蒸发仪的盛液瓶在105℃烘箱中烘至恒重，然后将超滤液导入其中进行减压浓缩，最后放入105℃烘箱中烘至恒重，其中干物质是分子量小于1000 Da的寡肽和游离氨基酸的混合物，再计算出混合物中的游离氨基酸重量，即可确定出肽产品中的寡肽比例。

计算公式：样品中寡肽比例T寡肽=（W_寡肽+FAA-W_FAA）／（W_肽样一 H_样品× W_肽样）。其中W_寡肽+FAA为寡肽与游离氨基酸混合物重； W_FAA为游离氨基酸重， W_FAA＝ 0．0502×W_肽样；W_肽样为样品重量；H_样品为小肽制品含水比例。

结果见表2

表2小肽制品中水分、

游离氨基酸、寡联和大联含量 %

	占小肽制品含量比例	占小肽制品干物质含量比例
水分	5．634
游离氨基酸	5．021	5．32
寡肽（分子量＜1000Da）	85．486	90．59
大肽（分子量＞1000Da）	3．859	4．09

（参考文献略）