评估比较蛋氨酸源试验的设计

摘要：

饲料原料效价的比较试验是营养师和采购商们做决定的关键。但是，只有这些试验采用合理科学的方法操作，使用正确的统计模型分析，才能提供有价值的信息。

本文将回顾近期发表的比较蛋氨酸源的研究论文，即：d, l-蛋氨酸与蛋氨酸羟基类似物效价比较的田间试验。很明显， 在非等价水平下比较蛋氨酸源以及没有采用公认的统计学方法分析试验结果，这种试验的讨论都是无效的。

导言：

蛋氨酸在家禽日粮中是第一限制性氨基酸，在猪和反刍动物的日粮配方中也扮演着重要角色。日粮中常用粉状d,l-蛋氨酸或液态蛋氨酸羟基类似物。

液态蛋氨酸羟基类似物是一种有88%活性的蛋氨酸源，化学名为2-羟基-4甲硫基丁酸(HMB)，通常简称为MHA或MHA-FA。另外一种形式的蛋氨酸是d,l-蛋氨酸，是一种99%活性的粉状蛋氨酸源，通常简称为DLM。

自从1970年液态蛋氨酸羟基类似物问世以来，改变了在日粮中和饲料厂里添加氨基酸的“公认”方式。液态产品能够通过全密封、高技术的传输系统自动添加。这对饲料厂而言，改善了混合均匀度，节省了劳动力和贮藏成本，减少了来自粉状蛋氨酸的粉尘。另外，由于99%粉状与88%液态蛋氨酸的浓度不同，因此必须添加不同数量的产品到日粮配方中，以保证提供相同数量的蛋氨酸。这种不同的蛋氨酸源在饲料配方中添加量的改变很快就被接受了，正如现在的营养师添加粉状与液态赖氨酸，或是VD与羟基-VD（VD的类似物）。

因此，营养师理解两种蛋氨酸化合物的不同，根据提供给动物的蛋氨酸“量”来调整配方，在最终的日粮中提供同等水平的蛋氨酸。今天MHA的使用已经超过了DLM，艾丽美已成为蛋氨酸添加剂的工业标准，这就是有力的证据。然而，由于MHA和DLM蛋氨酸活性的不同而出现了较实际情况更多的混淆。

最近，饲料工业界已从MHA和DLM的比较中苏醒过来（Hoehler等2000;Lemme等2002a;lemme等2002b）。混淆通常表现在做比较的田间试验设计上。（换句话说，除了设一个对照组外，还有多个重复和未达到最佳标准的蛋氨酸水平组。）最具代表性的是：这些试验配方中DLM的活性为99%，而与之比较的MHA活性则用65%，来替代其真实可保证的蛋氨酸活性88%。这类试验设计的第二个版本是：以88%蛋氨酸活性的MHA与65%的DLM比较，而DLM的实际蛋氨酸活性为99%。

第三个令人困惑的版本是将DLM计算为88%蛋氨酸活性的MHA的65%。然而，这个最终使产品比较复杂化的试验设计方式是建立在两个化合物的重量相等的基础上。这些设计自始至终都声称：如果两个产品同等地作用，则MHA必定只提供65%的蛋氨酸活性。

表面上看，这些比较似乎有道理。然而，他们错了。

这些试验不仅不切实际（不符合工业化-日粮配方），而且在科学和统计学上也是无效的。即便是进行简单的对照试验，也存在问题。

我们的目的是帮助营养师和生产者理解：为什么这些类型的比较是不正确的，以便他们能就选择何种蛋氨酸源做出正确的决定。下面说明为何这些实验设计是不切实际的。

不等价的试验设计类型

A．剖析“65%”的试验

实际的田间试验以99%的DLM与估计为65%蛋氨酸活性的MHA比较（替代实际为88%蛋氨酸活性的MHA）将不会显示生产性能的不同。因为这种类型的设计过分简单化，其结果是：超量添加了蛋氨酸源——MHA（见例1）。因为当MHA被估计为较低的蛋氨酸活性65%时，就必须在日粮中添加更多的MHA以达到希望的蛋氨酸水平。因此，当MHA以65%的效价计算时，日粮的蛋氨酸水平是过量的，而且超出了动物的实际需要量。

实际的工业化饲料日粮是以满足动物的蛋氨酸需要量来配制的。因此，无论使用何种蛋氨酸源，当超量添加时，不能观察到生产性能的相应提高。因为，当低估MHA蛋氨酸活性为65%以替代其实际的88%蛋氨酸活性时，没看到生产性能的变化。然后就很容易地得出错误的结论：产品只提供了DLM的65%的蛋氨酸活性。

一个相反的设计同样是真实的：蛋氨酸活性为88%的MHA与DLM活性被假设为65%相比。因为动物蛋氨酸的需求已满足就看不到生产性能的反应，无论计算日粮配方时产品的蛋氨酸活性是65%或是25%。

例1——理解数字

作为参考，在工业化生产中，日粮平均的蛋氨酸添加比率是0.20%。如果一个日粮添加蛋氨酸为：

0.20%的蛋氨酸水平，用99%活性的DLM，则日粮添加量为0.202% DLM。（0.20%蛋氨酸除以 99%的活性等于0.202%的DLM添加量）

0.20%的蛋氨酸水平，用88%活性的MHA，则日粮添加量为0.227% MHA。（0.20%蛋氨酸除以 88%的活性等于0.227%的MHA添加量）因为MHA含有12%水分，为达到蛋氨酸在最终日粮中等量，MHA添加量会多一些。

当假定一种蛋氨酸产品蛋氨酸值较低，为保证提供足够的蛋氨酸活性，就必须在日粮中添加更多的产品。

表1 不同蛋氨酸活性的添加量

来源 活性 %活性的相应添加量

MHA 88%

日粮添加量% 0.227

(日粮添加量%) 75% 65% 55% 45% 35% 25%

0.266 0.307 0.363 0.444 0.571 0.800

DLM 99%

日粮添加量% 0.202

**注意：在日粮中添加0.2%的蛋氨酸水平，不论添加哪一种蛋氨酸源，较低%的蛋氨酸活性，必须在日粮中添加更多的量。

因此，为什么在实际日粮中添加过量的蛋氨酸生产性能没有提高？

(在反应曲线的高峰，生产性能的差异非常小)

让我们看一看与蛋氨酸相关的典型生物学反应曲线。以上图表显示的是一个典型的肉鸡体增重反应曲线。随着蛋氨酸添加剂的增加，肉鸡的体增重也随之增加，直到达到了动物的生物需要量，即直到蛋氨酸的需要量满足了动物最佳的生长需要。在上图中，这个值大约在0.15~0.20%之间。如上所述，肉鸡生长期蛋氨酸的工业添加量平均为0.20%。

如果假设MHA有65%的蛋氨酸活性，相当于在日粮中添加了0.307%的蛋氨酸（见表1），因为已经达到在体增重反应曲线上的稳定水平，即已经满足动物的蛋氨酸需求，动物的生产性能将不会有反应。无论是添加0.20%或是0.30%的蛋氨酸都不可能期望观测到家禽生产性能的差异。因此，在实际的饲料日粮中，动物的营养需要是为了满足最佳的生长，在这个65%类型的试验中，动物的生产性能理应是没有差异的。

同理，MHA的活性为88%，而DLM为65%也不可能显示生产性能的差异。这种设计不能证明一种产品的蛋氨酸活性胜过另一种，而反倒可以被营养师用于确定蛋氨酸+胱氨酸的“安全限量”。因此，如果您被建议这种类型的比较，则需要更进一步的看看下面的例2。

例2 ——认为DLM小于99%

再者，确定蛋氨酸的添加水平为0.20%，即：MHA在日粮中添加0.227%（例1）。假设DLM用MHA的65%水平计算，如果是这样的话DLM的添加量就是0.227%MHA的65%，那么DLM在日粮中的添加水平将是0.15%（0.227%*65%=

0.15%)。另外，值得注意的是：在蛋氨酸活性方面，补充DLM为MHA的65%，相应的蛋氨酸活性供应水平应为75%。同样地，MHA也不是65%的蛋氨酸活性（0.15/0.20=0.75）。

如上述的曲线图，即使是0.15%的蛋氨酸添加水平，DLM所提供的结果与预期的最佳生产性能点也十分接近。从数值上看，图表上显示的日增重间差异仅仅只有10~15克。重点强调的是由于正常的田间试验变异，这种体重的大小变化是完全可以忽略不计的。这种类型的试验设计也不能证明一种产品的蛋氨酸活性胜过另一种。这只能简单地说明动物对日粮添加蛋氨酸+胱氨酸的生物学反应。

B.产品在重量基础上的比较

尽管较65%的试验略有差异，但仅仅是基于重量对重量的比较产品试验不仅使人迷惑，而且不经意的读者也很难察觉实验方法上的缺陷。

根据供给动物的蛋氨酸量，用一个重量单位的MHA替代一个重量单位的DLM所提供的蛋氨酸是不等的。诚如上述的讨论，这归因于这样一个事实：MHA提供88%活性的蛋氨酸和12%的水分，而DLM提供99%活性的蛋氨酸。例3，阐明了为什么在一个重量对另一个重量基础上比较产品是错误的。

例3——同一重量的基础上比较产品

近来的一个试验设计包括4个水平的蛋氨酸日粮（0.06, 0.12, 0.18和0.24%）。这4个水平由百分比决定添加产品，或相当于一个“重量”基础作为对应的一个等价蛋氨酸基础。

表2 日粮处理的蛋氨酸添加量

来源 添加产品% 或公斤 蛋氨酸活性% 蛋氨酸添加量%

DLM 0.06 或 (0.544) ×99 0.060

MHA 0.06 或 (0.544) ×88 0.053

DLM 0.12 或 (1.089) ×99 0.120

MHA 0.12 或 (1.089) ×88 0.106

DLM 0.18 或 (1.633) ×99 0.180

MHA 0.18 或 (1.633) ×88 0.158

DLM 0.24 或 (2.177) ×99 0.240

MHA 0.24 或 (2.177) ×88 0.211

如上表2，从每一个日粮处理组的蛋氨酸添加量%可以看到：家禽没有消耗同样数量的日粮蛋氨酸。例如：0.24%处理组，DLM的蛋氨酸添加量为0.24%，而

MHA是0.211%，相差0.029个百分点。既然每种日粮给家禽提供了不同数量的蛋氨酸，就不能期望有相似的生产性能。

在解释或分析比较不同产品的结果之前，必须了解这些产品是怎样被比较的。仅仅是在重量基础上用一种产品替代另一种的试验，或是超量添加试验，或是低量添加一种产品的试验，例如“65%”的试验，很难解释这些结果。事实上，运用统计学上的比较更是毫无意义。如下面的讨论：

统计学的应用：

检验任何科学理论，必须有一个恰当的假设。回顾统计学：无效假设是“效价是均等的”；对应假设是“效价是不均等的”。更精确的表达如下：

H₀: μ₁=μ₂ （无效假设：效价是均等的）

H_A: μ₁≠μ₂ （对应假设：效价是不均等的）

统计学的理论是设计检验以上的假设。“65%”的试验，或是在一个重量基础上比较产品的试验，都没有检验上述的无效和对应假设。这些试验是有计划的。当产品不同时，则无效假设是一定的；当产品相同时，对应假设是一定的。相反的假设可以表示为：

H₀: μ₁≠μ₂ （无效假设：效价是不均等的）

H_A: μ₁=μ₂ （对应假设：效价是均等的）

底线是统计学的工具不是有计划地检验这第二个设定的假设。因此，这些试验在统计学上讲是无效的。为了正确地应用统计工具，必须假定两种产品提供了同样的蛋氨酸活性。这些统计学规则无论是用于分析数据，还是用于方差分析，或是用于回归分析都是适用的。

当分析整个实验时，关键是检验方差分析的结果；当说明数据时，同时也应注意误差。与其他试验相似，当方差分析显示没有差异时，就没有证据表明一个产品与另一产品有差异。

例4——生产性能上无差异

Pack 等1999年发表了一个比较两种蛋氨酸产品在提供等量的蛋氨酸活性方面的试验。试验结果：既有体增重，也有方差分析（见表3）。从表中可以看出：试验组与对照组相比有显著的差异。而在试验组内，两种蛋氨酸源间在每水平上的差异都不显著。即：从统计学上讲，不能说明一种产品比另一种产品更有效。即使用方差分析也没有发现统计学上的差异。

表3 42日龄肉鸡在DLM或AT88不同添加水平下的生产成绩

事实上，如果方差分析显示没有统计学上的差异，就意味着回归技术不能再检测数据。以往，回归分析用于预测数据的趋势，而不是用于比较两种不同的产品。然而，如果选择应用这些模型应仔细操作，且应遵守模型的所有假设。

也应切记：方差分析的结果和回归分析的结果不应得出不同的结论。在同一种情况下两种统计方法显示的结果不同，这很好的说明了这些数据变异很大，因此不能说明问题。

结论：

当设计试验比较MHA与DLM时，必须注意两点：第一，应考虑动物的生物学反应曲线。第二，用正确的统计学试验比较两种产品，从开始添加产品就必须在相等的活性基础上，也就是说DLM的效价是99%蛋氨酸活性，MHA的效价则是88%的蛋氨酸活性。

简单的超量添加或是低量添加，或者是基于相同重量的产品替代试验，都不能恰当地比较蛋氨酸源的等价性。这些试验只是在制造混乱和疑问。比较蛋氨酸源不必太复杂，最佳的方法是有理有据而又合乎逻辑的简单设计。

参考：

1. Pack, M., Hoehler, D. and Brennan, J.J., 1999. Efficacy of liquid MHA-FA as compared to D,L-methionine on performance and carcass quality of broiler chickens. Proc.WPSA 12^th European Symposium on Poultry Nutrition. Veldhoven,Nethlands.

2. Hoehler, D., Irish, G.G., and Mannion, P.F., 2000. Estimation of bioefficacy of methionine sources in chickens. Proc.21^st world’s Poultry Congress,Montreal,Canada.

3. Lemme, A., D.Hoeheler, J.J. Brennan and P.F. Mannion, 2002a.Relative effectiveness of methionine hydroxy analog compared to D,L-methionine in broiler chickens. Poult.Sci. 81 : 838-845.

4. Lemme, A., D. Hoehler, J. J. Brennan, and P.F. Mannion, 2002b.Relative effectiveness of methionine sources in chickens. Feedstuffs 74(36) :13-15.