色氨酸的酶法生产

    色氨酸是人体内8种必需氨基酸之一，由Hokinst于1902年首先从酪蛋白中水解分离获得[1]，为α-氨基-β-吲哚丙酸，有L-型和D-型两种同分异构体[2]。L-色氨酸又称为L-胰化蛋白酶氨基酸，是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，其结构式为：

     分子式为：C11H12N2O2，分子量为204.23，为白色或略带黄色叶片状结晶或粉末，水中溶解度1.14克（25℃），溶于稀酸或稀碱，在碱中稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚，对人和动物的生长发育、新陈代谢起重要的作用，被称为第二必需氨基酸[3]，广泛用于医药、食品和饲料等方面。D-色氨酸化学名称是D-α-氨基-β-吲哚基丙酮酸，与L-型的物理化学性质几乎完全相同，仅旋光性相反，但它们的分布、功能及辅酶具有多样性，熔点很高，一般在200度以上，能溶于水，在近紫外光区域有吸收光的能力。D-色氨酸作为一种非蛋白活性氨基酸，具有特殊的生理学性质，在食品饲料工业以及农业中也有一定的价值，可以作为非营养甜味剂、饲料添加剂、植物生长剂，特别是在医药行业中，D-色氨酸是抗癌剂和免疫抑制剂的重要的合成前体。
     我国的色氨酸生产尚处于科研阶段，在国内仍是空白，使用上也仅限于在输液中应用，其它应用领域无法开发，依赖从日本进口。
1 色氨酸的生产方法
      国内外报道的生产色氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法四种[4]，其中酶促转化法是目前较为有效的工业方法。近年来人们更倾向于将色
     氨酸酶用于L-色氨酸的生物合成，因为底物吲哚对色氨酸合成酶抑制强烈，而对色氨酸抑制较弱，主要参与的酶系有色氨酸合成酶和色氨酸酶。
1.1  L-色氨酸的酶法生产[5][6]
     酶法生产是利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生产色氨酸，这些酶包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等，既发挥了有机合成技术的优势，又有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少和精制操作容易的优点，是一种成本较低的生产色氨酸的工业生产方法。至今报道的用酶法合成色氨酸的途径可归结为3种。
1.1.1 吲哚和丝氨酸为原料的酶法，合成途径为[7]：

      1979年MILLS报导了吲哚和D，L-丝氨酸作为前提物在色氨酸合成酶的催化下，利用一步法生产出L-色氨酸[8]。随后，Wongibang等人报道，具有高活力色氨酸合成酶的大肠杆菌细胞作为酶源，从吲哚和D，L或L-丝氨酸直接生产L-色氨酸。中国药科大学的韦平和、吴梧桐[9]用色氨酸酶基因工程菌WW-4催化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸，吲哚转化率为90.1%，产品总回收率达到70%。但该反应是色氨酸水解的逆反应，要求底物浓度较高，反应平衡不易把握。他们用色氨酸酶基因工程菌催化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸，所用底物L-半胱氨酸可通过毛发水解提取L-胱氨酸电解还原制得，产量高，价格低，有重要的工业化价值。
2.2  D-色氨酸的酶法生产
      酶法生产D-色氨酸具有区域和立体选择性强、反应条件温和、操作简单、成本较低、公害少等优点，且能完成一些化学合成难以进行的反应，已经受到有机化学家、药物化学家和微生物家们的高度重视。随着当代生物技术的发展，基因工程、细胞工程、酶工程等新技术的引入，微生物转化的发展已经具有了高度的研究价值以及广阔的实际应用前景[10]。
2.2.1转氨酶法
 　  枯草杆菌属等体内存在着D-氨基酸转移酶[11]，它属于枯草杆菌属、细菌等。与各种L-氨基酸、氨基转移酶比较，D-氨基酸转移酶最大的优点是对L-氨基酸完全没有作用。在此法中，D-丙氨酸作为氨基的供体，而氨基的受体是吲哚丙酮酸。D-色氨酸对底物的相对得率仅为13%。此法中由于吲哚丙酮酸与D-丙氨酸酶的结合性较差，因此需要提高酶的用量和延长反应时间才能获得较高的产率。一般而言生物直接转化获得D-色氨酸涉及到基因工程对生物和蛋白质酶的改造，目前还是在初级阶段，从生产角度而言，没有竞争优势。
2.2.2 海因酶法
 　 海因酶法是广泛存在于动植物组织中的一种水解酶[12]，它不仅能水解打开二氢嘧啶环，并且还可以水解与二氢嘧啶结构类似的海因类化合物，中性的天然或非天然的氨基酸的海因都可作为此酶的底物。D-海因水解酶和D-氨甲酰-N-色氨酸酶是D-型特异性酶，该酶反应在偏碱条件下进行，未反应的L-吲哚甲基海因自动消旋，则可保持D-型不变地生成色氨酸，所以从化学计量上讲，D，L-吲哚甲基海因都可以转化为D-色氨酸。该法制备D-色氨酸过程中的两个酶可以利用基因工程的方法来进行构建，得到的酶活性高、专一性强、产物得率高等优点。目前海因酶法制备D-色氨酸的研究相当活跃，其中利用基因工程菌制备已经实现工业化生产。
2.2.3 消去法
      Yamamoto等人利用色氨酸降解DL-色氨酸，产生吲哚、氨和丙酮酸，然后分离代谢物，以提高体系中的D-色氨酸含量。色氨酸酶由微生物培养得到，这些微生物可以是变形菌，气单孢菌属，肠杆菌属，以及共生菌等。L-色氨酸的代谢产物吲哚是色氨酸酶的抑制剂，可以通过加入表面活性剂与吲哚能铰链的多聚物以及难溶于水的有机溶剂等措施来降低体系中的吲哚含量。丙酮酸色氨酸酶的抑制剂，可能通过化学法去除，也可以通过加入微生物来降解而不会影响色氨酸的质和量。此法制得的D-色氨酸产率大于90%，光学纯度48.8%。但缺点是在处理过程中消耗掉了DL-色氨酸中的L-色氨酸，所以从经济学角度上讲不太适合。
2 色氨酸在医药上的应用
      由于D-色氨酸的特殊生理学性质，主要用于合成各种多肽，代替L-色氨酸延长肽类药物的半衰期并降低副作用，不致产生抗药性而成为酶抑制剂的重要合成前体[13]。D-色氨酸能提高机体的免疫能力，延缓过敏性反应的发生。大多数多肽类抗生素能抗革兰氏阳性菌，也有的对革兰氏阴性菌如绿脓杆菌、分枝杆菌、真菌、病菌、病菌和肿瘤细胞等有较好的抑制或杀灭作用。
      用D-色氨酸合成半合成抗生素，其侧链对于其药理功能起着重要的作用，肽键很难被β-内酰酶作用，从而有较高的稳定性，而且有抗菌谱广，毒性小，过敏性低，吸收快，血浓度高，药力持续时间长等。
 　  严重肝病除有血氨的增高外，也有血清游离色氨酸的变化。氨和色氨酸代谢紊乱与肝性脑病的发生及肝损害的程度有密切关系。色氨酸参与人体内多种代谢途径。人血清中色氨酸大部分和白蛋白结合，只有10%左右以游离存在，同时肝脏对色氨酸分解代谢能力的降低及重型肝炎时的肝实质细胞本身释放色氨酸，使血清色氨酸增高，因此，色氨酸代谢紊乱促使肝性脑病发生的主要因素之一。
      人们对色氨酸的研究经历了近30年，色氨酸作为必需氨基酸在输液、健康食品、饲料添加剂等方面应用也日益广泛，但是也存在着一些困难需人们去解决，比如作为底物之一的丝氨酸价格昂贵，无形中就提高了生产成本；色氨酸生物合成的调控系统比较复杂；吲哚难溶于水，转化率不高等等，因此对色氨酸的生产方法还需要进一步的研究。

参考文献略
网络刊物