酵母培养物调控瘤胃微生物区系研究进展

摘要：酵母培养物（YC）作为饲料添加剂在反刍动物生产中应用较为广泛。本文主要从其对瘤胃微生物区系的影响及作用机理，以及影响酵母作用效果的因素展开讨论，为此方面研究提供一些理论基础。
关键词：YC；微生物区系；作用机理

MANIPULATION OF YEAST CULTURE TO MICROFLORA

LONG Ling，GONG Yue-sheng
（College of Animal Science and Veterinary Medicine,Northwest
Sci-Tech University of Agriculture andForestry, Shannxi, 712100 China)

Abstract: Yeast culture (YC) is widely used as a feed additive for ruminants production. Researches indicate that YC can stimulate the growth of specific microorganisms in rumen, so as to improve animal production. It reviews the effect of YC on rumen microflora, the possible action mechanism, and the factors involved in the efficiency. Research progress and prospect on YC was discussed.
Key words: Yeast culture; Rumen microflora; Action mechanism

通过调控瘤胃微生物区系来加强反刍动物对粗饲料的利用近年来成为反刍动物学家和营养学家研究的热点。目前存在许多方法用以调控瘤胃微生物区系，如应用离子载体和抗生素。但对于饲料工业中应用抗生素所引起的问题和寻求安全饲料的广泛关注，促使研究者致力于发展一种新型非抗生素或“天然”的饲料添加剂。微生物饲料添加剂，即直接饲喂微生物（DFM），完全满足发展需求，因而被推到了历史前台。DFM包括细菌、酵母（真菌）等，许多研究证明DFM使用效果良好，尤其是酵母培养物（Yeast Culture，YC）。
YC 是经严格控制条件的液体、固体二级发酵或直接在固体培养基发酵后连同培养基一起加工制得的产品，含有酵母菌及其赖以生长的培养基，以及酵母代谢产物。目前国内外制备YC的常用菌种为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）, 并常添加有米曲霉（Aspergillus oryzae）或其提取物以及乳酸杆菌（Lactobacillus）。
YC最初是用作刺激反刍动物瘤胃微生物的一种生长因子，主要通过酵母代谢产物和酵母菌的作用调节动物肠道或瘤胃内微生物平衡，刺激有益菌生长，防止疾病，提高动物生产性能。大多结果表明，YC对改善反刍动物瘤胃的微生物生态，刺激某些有益的细菌生长，促进动物生长和提高产奶量的作用较为明显，而且对反刍动物的营养作用明显优于单胃动物。
本文主要从YC对瘤胃微生物区系的影响及作用机理，影响酵母作用效果的因素，以及研究现状和发展方向这几方面作一浅述，以期为后续研究提供一些理论帮助。
1 YC对瘤胃微生物区系的影响
日粮中添加YC能选择性刺激瘤胃特定微生物，改变微生物区系，使瘤胃内有益微生物浓度升高及活性加强，有利于粗纤维及其它营养物质的消化，以及破坏、降解能导致瘤胃失衡的代谢中间产物。
YC对反刍动物生产性能的影响主要是通过瘤胃内微生物菌群的变化起作用。添加YC的作用之一是通过培养一个健康并活力旺盛的纤维分解菌群而有助于提高纤维消化率。大量研究表明，日粮中添加YC能增大纤维分解菌浓度及增强其活性。

图1 YC作用机制模型
Dawson（1990）报道，在以粗饲料为基础日粮的培养基中添加YC使纤维分解菌浓度升高（P<0.05），进一步试验证明，阉牛瘤胃中纤维分解菌浓度随YC添加量的增加而增加[1]。添加YC也能提高饲喂高粗饲料奶牛瘤胃的纤维分解菌数量，但差异不显著（Erasmus等，1992）[2]。Wiedmeier（1987）试验发现，在非泌乳奶牛日粮中添加YC使纤维分解菌数量增加近40%（P<0.05），米曲霉发酵提取物使纤维分解菌数升高达27%（P<0.05）。反刍动物日粮或瘤胃模拟装置中添加YC可稳定瘤胃环境，尤其是使pH值升高，这可用来解释总厌氧菌和纤维分解菌浓度的升高
有些研究者认为，YC虽能刺激纤维分解菌数量的增长，但并不对纤维消化的程度发生影响。Newbold等（1991）发现，米曲霉和酿酒酵母增强了瘤胃微生物对纤维消化的速度，但不提高其对纤维消化的程度[3]。Callaway等（1997）报道，在含6g/l纤维二糖的培养基中加入酿酒酵母滤液，能刺激纤维分解菌（产琥珀酸拟杆菌S85、黄化瘤胃球菌FD1和白色瘤胃球菌B199）对纤维二糖的利用，但只是增加了产琥珀酸拟杆菌S85和黄化瘤胃球菌FD1对纤维消化的起始速率，并不影响消化度[4]。
营养物质在瘤胃内的迅速发酵所产生的大量有机酸导致瘤胃pH值的下降，过低的pH值会抑制瘤胃微生物的生长，降低动物对营养物质特别是粗纤维的利用，严重时导致瘤胃功能失调。瘤胃内pH值的适当升高，有利于瘤胃微生物的增殖，从而促进营养物质消化利用，尤其是瘤胃内氨氮的利用。研究发现，添加YC能促进乳酸利用菌的生长，维持瘤胃内环境的恒定。YC能刺激含乳酸培养基中乳酸利用菌的生长，给饲喂高能量的育肥牛补饲YC也能提高乳酸利用菌的浓度[7]。Linehan等（1978）向含有乳酸的培养基中加入0.5%酵母提取物，使反刍兽新月单胞菌HD4的生长提高了3.8倍，而在不含乳酸的培养基中加入酵母提取物，对其生长只有轻微促进作用，说明酵母能促进乳酸利用菌利用乳酸。并有报道表明在高精料日粮中补加酵母不但增加了乳酸利用菌的浓度，也加快了乳酸利用速率[8]。
米曲霉培养基滤液中的一些因素可以抑制乳酸的利用[4]。如葡萄糖是一种优先底物，抑制了反刍兽新月单胞菌对乳酸的利用。滤液中存在葡萄糖、乳酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸和天冬氨酸，即使反刍兽新月单胞菌利用乳酸过程中需要有机酸（如天冬氨酸和苹果酸），葡萄糖同样会抑制放射性标记的L-乳酸在短期内（5min）的利用，但埃氏巨球形菌（Megasphaera elsdenii）对乳酸的利用不受分解代谢物的阻抑。YC滤液虽抑制了乳酸的短期利用（5min），但却能刺激反刍兽新月单胞菌和埃氏巨球形菌在含乳酸培养基中的长期生长（24h后）。
有关YC对蛋白分解菌及淀粉分界菌影响的报道并不多。但Yoon和Stern（1996）认为添加YC可能会提供某种因子刺激蛋白分解菌的生长[10]。Kumar等（1994）在水牛高精料日粮中添加酿酒酵母培养物，发现与对照组相比，淀粉分解菌的数量提高了近0.077%[11]。
活体试验表明，19~28%的纤维分解酶活性是由原虫产生的，但其消化仅局限于一些易受作用的组织，如叶肉细胞。研究证明去除原虫会降低纤维消化率。由于原虫离开细菌单独生长比较困难，因此普遍认为原虫在纤维消化中的作用比较微小。Frumholtz等（1989）研究发现，日粮中添加米曲霉使瘤胃原虫数量减少了45%，因而解释了为什么添加米曲霉能升高瘤胃菌数。原虫数量的降低会使其捕食细菌的作用减弱，因而米曲霉能使更多的细菌生存。
添加YC降低原虫数量或许不是YC的共性，正如许多研究中表明的，不同酵母制剂会对原虫产生不定的影响[11，13，14]。由此判断，酵母制剂的种类或许是影响酵母与原虫之间相互作用的重要因素。如Oellermann等和Fonderila等（1990）研究发现，米曲霉对原虫数量几乎没有影响[5，6]。也有人发现，YC能提高瘤胃中原虫数量。Kumar（1994）报道，在水牛高精日粮中添加酿酒酵母培养物能使瘤胃原虫数量提高0.079%[11]。卢庆萍（1999）试验结果表明，阉牛日粮中添加YC使瘤胃原虫数量提高了12.16%（P<0.05）。
Chaucheyras等（1995）报道，当向不含维生素的培养基中加入活性酿酒酵母后，能刺激厌氧真菌Neocallimatix frantalis MCH3的孢子产生纤维分解能力，使发酵产物如氢气、甲酸、乙酸、乳酸等浓度升高，表明酵母能增强厌氧真菌对植物细胞壁的附着[15]。经活酵母刺激后，真菌在瘤胃内降解木质素?纤维素饲草的能力也提高了。米曲霉发酵提取物能刺激与真菌Neocallimatix frantalis MCH3形态相似的真菌Neocallimatix frantalis EB188的生长及纤维分解酶的产生。Prange等（1979）收集日粮中添加米曲霉的奶牛十二指肠内容物，发现饲料颗粒上附着大量与正常瘤胃真菌群形态相似的真菌，但在不添加米曲霉的奶牛瘤胃内容物中却并未发现。
2 YC作用机理
到目前为止，研究者还未完全搞清YC对瘤胃微生物区系的作用机理，这仍然是个存在争端的领域。但研究者已提出大量假设去阐述它，概括起来，共有以下几个方面：
2.1 生长刺激因子
YC本身并不具有纤维分解活性，它的作用在于能为纤维分解菌提供一些可溶性生长刺激因子，如维生素B、氨基酸、有机酸、葡萄糖、支链挥发性脂肪酸或不明生长因子，来刺激瘤胃中利用乳酸和分解纤维的细菌生长。这些物质是某些瘤胃微生物生长、代谢所必需的。细菌纯培养时，反刍兽新月单胞菌HD4在含L-乳酸的培养基中生长需要L-天冬氨酸、β-氨基苯甲酸和生物素的参与，其中天冬氨酸可用L-苹果酸或延胡索酸代替[7，16]。但只有天冬氨酸、延胡索酸、苹果酸，而缺乏乳酸的培养基不能刺激反刍兽新月单胞菌HD4的生长[16]。反刍兽新月单胞菌H18（一个新分离的瘤胃细菌）在乳酸中的生长也需要天冬氨酸[17]。
胰胨是含肽和支链氨基酸的酪素酶解产物，而酵母提取物是维生素B和其它不明生长因子的绝好来源。YC滤液提供的生长因子与在胰胨和酵母提取物中发现的生长因子相同，它们是反刍兽新月单胞菌和埃氏巨球形菌在乳酸培养基中生长所必需的[4]。
YC虽能刺激总厌氧菌及纤维分解菌浓度的升高，但经研究发现，提供同样剂量的热灭活YC（121℃，15min）却不能刺激它们的增殖，说明YC的作用效果在很大程度上取决于酵母细胞在消化道内的代谢活性，发挥刺激作用的是活细胞或一些热不稳定产物[1]。添加到瘤胃模拟装置中的辐射灭活酵母仍能保持大部分刺激活性，而经高温高压灭活后，则丧失此活性[3，18]。这进一步说明YC刺激细菌生长的能力依赖于一种尚未知的热不稳定因子，因而将不明生长因子称为热不稳定因子。经分析发现，这些因子的基本特性与一些具有生物活性的小肽的基本特征一致，而在随后的瘤胃细菌培养中发现，小肽对其确有刺激活性，并且当浓度很低时，其刺激活性也很低，说明这些物质就是限制性营养因子，因此又有人将此机理称为小肽营养代谢扳机理论。
2.2 除氧效应
瘤胃为一厌氧环境，但即使是非瘘管牛，其瘤胃内氧气含量也占总气体量的0.5~1.0%。氧气对厌氧菌有害，能抑制瘤胃细菌生长及纤维分解菌对纤维的附着作用。酵母呼吸活动中需要消耗氧气，因而保护瘤胃严格厌氧菌免受氧气的破坏。Newbold等（1996）报道，将添加到瘤胃模拟装置中能刺激总厌氧菌和纤维分解菌数量增加的酿酒酵母的两种菌株NCYC240、NCYC1026和商业制剂Yea-Sacc以1.3mg/ml的浓度加入绵羊瘤胃液中，能将氧气的消失速率提高46~89%。而对细菌数没有影响的NCYC694和NCYC1088对氧气的消失速率不发生影响。并且发现，经溴化乙锭诱变，导致呼吸功能缺陷的酿酒酵母突变株NCYC240和NCYC1026也不能刺激瘤胃模拟装置中总厌氧菌及纤维分解菌的生长。

2.3 选择性刺激效应
研究发现，YC对某些细菌具有选择性，可刺激它们优先生长。添加YC刺激了可防止乳酸中毒的乳酸利用菌的优先生长[8]。酿酒酵母能刺激纯培养环境中乳酸利用菌（反刍兽新月单胞菌）的优先生长，这显然是因为酵母中的二羧酸促进了细菌对乳酸的利用[7]。YC选择性刺激效应从甘露醇利用菌上得到进一步证实。以甘露醇为唯一碳源的培养基对于反刍兽新月单胞菌有选择性刺激作用，取瘤胃液接种于该培养基上，其它细菌7天后才能生长。因此，目前研究中用在甘露醇培养基上生长的菌数来代表反刍兽新月单胞菌的数目。
2.4 自身效应
YC能产生多种酶类，如α-淀粉酶类、蛋白酶、纤维素酶和半纤维素酶等。瘤胃液中短链糖可能是α-淀粉酶对日粮谷物中淀粉作用的结果，而添加YC使这些糖浓度降低是引起乳酸下降的主要原因，因为一般认为日粮中添加糖和其它快速发酵饲料时会引起乳酸浓度的升高。经研究发现，米曲霉本身能产生纤维分解活性。虽然此项研究没有观察到影响纤维分解程度的条件，但米曲霉可能改善了细菌对稻草的附着和建群。米曲霉不能产生将结构性碳水化合物解聚成单糖的酶促机制，但它能引发酶发生部分解聚作用，在瘤胃纤维分解菌发挥解聚作用，将纤维性物质转变成单糖的过程中起到辅助作用。米曲霉自身也存在蛋白水解活性。体外法研究结果表明，米曲霉能增大挥发性脂肪酸的浓度，表明米曲霉能促进更多的蛋白水解，因为支链VFA是蛋白水解产物。
3 影响酵母添加效果的因素
大量研究结果表明，YC的作用效果并不稳定，几乎所有影响瘤胃环境及功能的因素都会对其产生影响，归纳后主要有以下几个方面：酵母（菌株、活性、剂量及存放时间）、日粮（类型及水平）、动物（生理阶段及生产水平）和饲养管理。
3.1 酵母
3.1.1 菌株
酵母菌株很多，美国国家菌株收集中心目前保存有1000多株生化或是基因特性不同的酿酒酵母属酵母菌，再加上其它属的菌种，应该说可以用作饲料添加剂的酵母菌种数量是很大的。许多研究者都在研究筛选区别不同酵母菌对促进瘤胃特殊微生物繁殖能力的大小，结果表明酵母菌株间对瘤胃微生物的影响存在明显差异。可以认为，有关酵母产品作用效果的差异很大程度缘于所用菌株的差异。
Dawson和Hopkin（1991）的试验测定了瘤胃微生物在纯培养时和与特定酵母菌系协培养时的生长和活性，发现几种酵母菌株可刺激纤维分解菌和乳酸利用菌的生长，而其它菌株的这种能力十分有限[20]。可见，酵母的作用与其菌系密切相关。Newbold等（1995）研究发现，酿酒酵母菌株NCYC240、NCYC1026和商业制剂Yea-Sacc能刺激瘤胃模拟装置中总厌氧菌和纤维分解菌的生长，但NCYC694和NCYC1088无此功能。进一步的体内试验证明，尽管NCYC240、NCYC1026和Yea-Sacc对绵羊瘤胃总厌氧菌和纤维分解菌有刺激作用，但只有NCYC1026对总厌氧菌和NCYC240对纤维分解菌的刺激作用达到显著水平（P<0.05）[14]。
3.1.2 活性
YC的刺激作用可能与酵母细胞在瘤胃中的生长与代谢活性有关。YC作为一种饲料添加剂，其代谢活性比繁殖能力更为重要。研究显示，经辐射而失去繁殖能力但仍具有代谢活性的酵母有促进瘤胃菌生长的能力[18]。研究发现，在39℃的瘤胃液中添加酵母，6h后仍然能保持代谢活性。
温度和加热时间可对YC代谢活性产生影响。Elizabeth（1994）通过测定酵母转化葡萄糖为二氧化碳的数量研究了不同时间的干热对酵母培养物代谢活性的影响（如表１所示）。

表１ 温度和加热时间对YC代谢活性（以产气量表示）的影响

结果表明，在70℃的温度下，不论加热时间多长都不影响YC的代谢活性。80℃加热5min其代谢活性为不加热组的90%，15min 则为70%。90℃加热15min活性只下降了60%。可见，在如此高的温度下，YC代谢活性虽有所下降，但总的代谢活性并未完全丧失。
死酵母或失活酵母能否保持代谢活性报道不一。经热钝化的YC制剂对瘤胃细菌的生长没有影响，这表明失活酵母丧失代谢活性[1]。在模拟瘤胃培养中进一步研究热杀死和活酵母对纤维分解菌的作用时发现，酵母的刺激活性依赖于酵母活细胞的热不稳定内容物。
3.1.3 剂量
随米曲霉浓度升高，瘤胃厌氧真菌数量有增大的趋势[6]。应用瘤胃模拟装置研究发现，随米曲霉添加剂量的增加甲烷产量呈降低趋势。Besony等（1996）给泌乳中期奶牛补饲不同水平的酵母液态产品时发现，随YC添加水平增加，乙酸比例降低，丙酸比例升高，乙:丙比值线形下降，乳脂率也随之下降。由此可见，YC的添加剂量会对反刍动物产生不定的影响，应视具体情况添加。
3.2 日粮
大量研究结果表明，YC与日粮之间可能存在互作关系，YC改变发酵方式的能力主要随日粮不同而异，日粮组成发生很小变化就会导致YC作用效果的较大变异。Spedding（1991）报道，饲喂添加YC的大麦日粮时阉牛日增重提高19%，而任意采食青贮料却只提高6.7%。Edwards等（1991）发现添加YC时，饲喂青贮料比饲喂高纤维的农副产品和高比例的大麦效果更好。当奶牛饲喂60%的精料和40%的秸秆时，补加YC使产奶量提高了17.5%，但用青干草代替秸秆时只增加了14%[21]。Quinone等（1988）研究发现，当奶牛饲喂苜蓿干草和小麦时，YC能刺激产奶量的增加，但当小麦被玉米代替时则无此效果。基础日粮类型影响YC的添加效果，而且似乎在高精料日粮的情况下，动物表现最大的生产反应[22]。Fallon（1987）报道，饲喂淀粉精料（高粱）基础日粮能提高犊牛的增重和营养物质的消化率，而饲喂非淀粉精料日粮（玉米面筋）的犊牛则无效果。
YC作用效果的差异部分是由于日粮特点不同，尤其是快速发酵碳水化合物的水平不同。有资料表明，当NSC（非结构性碳水化合物）浓度低于日粮中DM总量的25%时，YC的添加效果不显著，甚至会降低产奶量和饲料利用率。因为低NSC日粮缺乏足够数量的代谢能来维持YC在瘤胃内的存活和发酵，所以有产奶量下降6.8%的报道。在低NSC日粮中，YC的作用效果随日粮水平的升高而加强。当NSC浓度高于日粮DM总量的42.7%时，添加YC不但不能提高产奶量和饲料利用率，相反会有所下降。因为高谷物日粮能降低瘤胃内pH值，抑制瘤胃微生物活性，使YC失效。这就是Edwards（1991）用高水平日粮添加YC时，产奶量下降的原因，后来用青贮部分去代替大麦效果良好[23]。因而在高NSC日粮中，YC的作用效果随日粮中青、粗饲料的增加而升高。当NSC浓度适中，在30.5~35.5%时，日粮中添加YC能显著提高产奶量和饲料利用率。研究发现，当DM中NSC含量达38%时，添加效果最佳。Randy（1992）报道，奶牛日粮中NSC含量低于30%时，添加YC生产性能有所下降。因为反刍家畜瘤胃微生物需要充足的降解性输入蛋白和NSC，才能产生较多的细菌蛋白来发挥YC的作用。
当日粮精:粗比增大时，特别是对易发酵碳水化合物含量高的日粮，添加YC对提高奶牛产奶量的效果更加明显。随着精料逐渐取代低水平混合日粮，YC提高生产性能的效果将更加显著。Moloney（1994）采用高精料高质量日粮（CP172g/kgDM，CF357g/kgDM）进行试验，结果表明添加YC的阉牛瘤胃pH值下降，乙酸与丙酸比值降低，挥发性脂肪酸浓度增高（P<0.001），与Chademana和Offer（1990）用绵羊试验的结果一致，并且瘤胃氨浓度下降（P<0.05）[20]。而低精料低质量日粮组（CP104g/kgDM，CF646g/kgDM）上述指标不受影响，但蛋白消化率下降。
也有人认为，日粮营养水平越低，品质越差，添加酵母后日粮消化率提高幅度越大，使用效果越显著。
总之，YC的作用效果不可一概而论，而取决于添加时的日粮水平，过高或过低都不利于YC作用的发挥。
3.3 动物
在动物生理敏感期添加YC效果较为明显[2]。研究发现，YC对早中期泌乳牛的效果比晚期显著，提高了4%脂肪校正乳产量及乳脂率，并可提高乳蛋白率，使泌乳高峰期提前。因此，应在动物处在生理敏感期时添加YC，以取得较显著效果。Hoyos等（1987）试验表明添加YC使高产奶牛产奶量增加（32.8VS30.9kg/天），但对低产奶牛（22.3kg/天）没有影响；高产奶牛乳脂率增加了19.4%，低产奶牛仅增加14%[25]。由此可看出，生产水平不同会对YC的添加效果造成影响，添加前应搞清究竟在什么水平下YC能最大促进动物生产性能。

3.4 饲养管理
大量研究报道，奶牛粗饲料与精料分开饲喂时添加YC效果较为明显。Zinn和Borquez（1993）研究发现，添加YC对限饲肉牛只有轻微的促进效果，对自由采食肉牛却能提高瘤胃消化速率，增加瘤胃和全消化道有机物的消化率。添加YC时应注意给动物提供最适的饲养管理方式，发挥YC的最大效应。
4. 研究现状及发展方向
4.1 研究现状
目前对YC的研究多集中于生产应用水平及对瘤胃发酵、消化代谢和微生物区系影响的表观水平。大多研究表明：添加YC能提高反刍动物生产性能，表现在提高采食量、增重、产奶量及改善乳组成；YC能改善瘤胃发酵，稳定瘤胃pH值，并能YC能提高DM、NDF、ADF、CP的瘤胃消化率及全消化道消化率；YC能刺激瘤胃细菌数量及活性的提高。
为确定饲料中所添加YC的适当数量，保证一定程度上可靠的促生产效果，同时保证对动物安全无害，迫切需要对YC产品中酵母菌系进行鉴定。研究表明，基因指纹技术是一种有效的方法，因为不同酵母菌种所含大量的备选指纹序列本身就表现出菌种间差异。目前使用的标记指纹的技术有TY（Transposable yeast，可变换Y）因子和PCR技术的随机放大多态（RAPD）显示技术。前者可用来成功的标记酿酒酵母菌系的指纹，后者可用以区分极为相似的酵母菌系。
4.2 发展方向
近几年的研究结果证实，YC在许多不同的生产系统中对反刍动物的生长与生产性能都有显著的影响，然而获得最佳使用效果的适宜条件还不确定，今后的研究方向应集中于：（1）研究能够最有效地刺激瘤胃特种微生物区系活性的酵母作用机制；（2）深入研究确定适于各种类型饲料和不同生产条件下的刺激瘤胃微生物活性的酵母类型，即酵母菌种类型与饲料类型的配伍性，选择出能够使家畜产生理想反应的酵母菌种；（3）加强YC产品有效性的检测。除已有的基因指纹技术外，研究者还应致力于发展更快、更有效的检测方法。