几种常见饲料原料中抗性淀粉含量的测定

　Resistant starch,简称RS，这一概念由Englyst提出，国内大多数文章译为抗性淀粉，也有的将其译为抗淀粉及抗消化淀粉（杨参等，2003），1993年，欧洲抗性淀粉研究协会（EURESTA）将其定义为“健康者小肠中不被吸收的淀粉及其降解产物的总称”。抗性淀粉一般分为4类：ＲS1型（生理不可消化性截留淀粉）；ＲS2型(抗性淀粉颗粒)；ＲS3型(老化淀粉)；ＲS4型(化学改性淀粉)（Adamu.Augustine和金征宇，2000）。.Englyst等(1985，1987，1992)，杨光和丁霄霖(2002)分别就抗性淀粉的测定方法进行了讨论，但测定结果却不尽一致，本文通过参考Megazyme公司试剂盒提供的方法，结合国内实际情况，研究出一套准确，方便、快捷测定饲料中抗性淀粉含量的方法，为饲料行业测定抗性淀粉提供一种新的方法。
　　1 原理
　　先用胰α-淀粉酶（Pancreatic α-amylase）将非抗性淀粉水解成葡萄糖，再利用抗性淀粉能溶于KOH中的性质，用淀粉葡萄糖苷酶（Amyloglucosidase,AMG）使其水解成葡萄糖，然后测定糖的含量，从而推算出非抗性和抗性淀粉的含量。
　　2 仪器与试剂
　　2.1 仪器
　　GILSON移液枪，DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器（江苏太仓王秀实验设备厂），分析天平（0.000 1g），Beckman Synchron CX4/Pro全自动生化分析仪，WH-1微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂） ，离心机（Eppendorf Centrifuge 5810 R）。
　　2.2 溶液的配制
　　2.2.1 马来酸缓冲液（0.1M，pH=6.0）将23.2g马来酸溶解于1 600ml蒸馏水中，用4M（160g/l）NaOH调pH至6.0，加入0.6g CaCl22H2O和0.4g叠氮钠，蒸馏水定容至2L，室温保存。
　　2.2.2 醋酸钠缓冲液（1.2M，pH=3.8）取69.6ml冰醋酸于800ml蒸馏水中，用4M NaOH调PH至3.8，蒸馏水定容至1L，室温保存。
　　2.2.3 氢氧化钾（2M）称取112.2g KOH溶于900ml去离子水中，用玻璃棒搅动，使之溶解，去离子水定容至1L。
　　2.2.4 乙醇（50%，V/V）取526ml 95%乙醇于1L容量瓶中，蒸馏水定容，混匀，室温保存。
　　2.2.5 淀粉葡萄糖苷酶（Amyloglucosidase,AMG）工作液（300U/ml）：取1.0ml AMG母液（3300U/ml，Megazyme公司试剂盒提供），用马来酸缓冲液稀释到11ml. （注意：此试剂要求现配现用）

　2.2.6胰α-淀粉酶（Pancreatic α-amylase）反应液：称取1.0g胰α-淀粉酶(Megazyme公司试剂盒提供)用适量马来酸缓冲液溶解，转入于100ml容量瓶，加入1.0mlAMG工作液，振摇5min，摇匀，用马来酸缓冲液定容。溶液于12 000r/min离心10min，取出上清液，以备后用（注意：此试剂要求现配现用）

　　3 测定步骤
　　3.1 称取100mg（±5mg）样品于15ml离心试管（带盖）中，并轻轻敲打试管，使样品掉入试管底部。
　　3.2 每管内加胰α-淀粉酶（Pancreatic α-amylase）反应液4.0ml（现配现用）。
　　3.3 盖紧盖子，旋涡混匀，然后用橡皮筋扎紧（一般为六个试管一扎）。
　　3.4 将扎好的试管放入37℃的水浴恒温振荡器中（200次/min）水解，16h后取出。
　　3.5 用纸巾将试管外的水擦干，加入4.0ml乙醇（95%）旋涡混匀。
　　3.6 在离心机上于1 500g(大约3 000r/min)离心12min。
　　3.7 轻轻将试管移出（因为是低速离心，过重摇晃会使沉淀松散）将上清液倒入100ml容量瓶中，向剩下的沉淀中加入2ml乙醇（50%）旋涡混匀，再加入6ml乙醇（50%）旋涡混匀，仍然在1 500g离心12min

　　3.8 重复步骤3.7一次。
　　3.9 将上清液倒入原先的100ml容量瓶中，将试管倒置，用滤纸吸干试管内液体（防止非抗性淀粉水解成的糖转入下一步抗性淀粉的水解过程中）注意：只有在沉淀吸附得比较牢固时才能用，当沉淀比较松散时则尽量将上清液倒出后立即扶正试管。
　　3.10 将上述100ml容量瓶用蒸流水定容，摇匀。吸取100μl溶液至Beckman Synchron CX4/Pro全自动生化分析仪样品杯中，测定葡萄糖（GLU），计算出非抗性淀粉含量。
　　3.11 向试管中加入2.0ml KOH溶液（2M）冰浴振荡20min（注意不能旋涡混匀）
　　3.12 向每管中加8.0ml醋酸钠缓冲溶液(1.2M，pH3.8)摇匀。
　　3.13 加入100μl AMG酶液（3 300U/ml），盖紧盖子，反复摇匀，用橡皮筋扎紧，放入50℃水浴恒温振荡器中（200次/min），30min后取出。
　　3.14 1 500g离心12min，吸取100μl上清液至Beckman Synchron CX4/Pro全自动生化分析仪样品杯中，测定葡萄糖（GLU），计算出抗性淀粉含量。
　　4 计算公式
　　非抗性淀粉含量=G×（100/W）×0.9×100%

　　抗性淀粉含量=G×（10.3/W）×0.9×100%

　　总淀粉含量=非抗性淀粉含量+抗性淀粉含量
　　式中：G——水解样中葡萄糖含量(mg/ml)

　　W——样品干物质重量(mg)

　　0.9为淀粉与葡萄糖的转换系数
　　A式中100代表体积100ml；
　　B式中10.3为一经验值，表示步骤3.14中上清液的总体积为10.3ml。
　　5 应用实例
　　根据上述方法，对不同物质中抗性淀粉与非抗性淀粉的含量进行了测定。由此不难看出：土豆粉和芋头中抗性淀粉的含量非常之高，其次为玉米等，而小米，燕麦等物质中抗性淀粉的含量则比较少。