饲料中氢化可的松的测定方法研究

　摘 要 高效液相色谱法测定饲料中的氢化可的松，提取方法简单，测试数据重现性好，平均回收率高于90%，平均变异系数I小于7%，精密度和准确度均能满足分析要求。
　　关键词 氢化可的松；回收率

　　氢化可的松（Hydrocortisone）化学名为11β，17α，21－三羟基孕甾－4－烯－3，20－二酮－21－甲醇。

　　氢化可的松属肾上腺皮质激素类药物，主要作为人畜抗炎症、抗过敏、抗休克，在饲料中使用能起到治病、促生长作用，对猪的增重效果明显，但其残留可引起类肾上腺皮质亢进综合症、心血管、消化系统并发症及骨质疏松、肌肉萎缩等，严重威胁人们的身体健康。研究饲料中的氢化可的松检测方法有助于加强监督管理，据此，我们研究了用甲醇提取试样中的氢化可的松，以乙腈、水作为流动相，用高效液相色谱—紫外检测法分离对氢化可的松进行测定。

　　1 材料与方法
　　1.1 试剂和溶液
　　1.1.1 试剂
    乙腈为色谱纯、甲醇为色谱纯。
　　1.1.2 氢化可的松标准液
　　1.1.2.1 氢化可的松标准贮备液
    准确称取氢化可的松标准品（纯度≥98%）0.100 0g，置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容，其浓度为1 000μg/ml的储备液，置于4℃冰箱中保存。
　　1.1.2.2 氢化可的松标准工作液
    分别准确吸取一定量的标准贮备液（1.1.2.1），稀释10倍，用甲醇稀释，定容，配制成浓度为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、17.5μg/ml的标准工作液。
　　1.2 仪器和设备
    高效液相色谱仪为配紫外检测器、电子天平为感量0.000 1g、离心机为3 000r/min、振荡器、玻璃具塞三角瓶为250ml、微量进样器、微孔滤膜为0.45μm。
　　1.3 测定步骤
　　1.3.1 试样制备
    按GB/T 14 699.1抽样，取有代表性的样品，四分法缩减取约200g，经粉碎全部过40目孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。
　　1.3.2 提取
    按不同的饲料产品，准确称取配合饲料、浓缩饲料2~10g，预混料0.5~4g（准确至0.000 2g）样品，置于250ml玻璃具塞三角瓶中，加入40ml甲醇，往复震荡30min，静止10min过滤，再向饲料中分别加入30ml甲醇，重复提取2次。合并3次提取液，用甲醇定容至100ml。取10ml置离心管中，3 000r/min离心5min，取上清液用0.45μm微孔有机滤膜过滤作为试样制备液，供高效液相色谱分析。
　　1.3.3 测定
　　1.3.3.1 HPLC色谱条件
    色谱柱：C18柱，长240mm，内径4.6mm(i.d.)，粒径5.0μm，或相当者；柱温：室温；流动相：乙腈+水＝25+75（V+V），流速：1.0ml/min；波长：254nm，进样体积：20μl。
　　1.3.3.2 HPLC定量测定
    按仪器说明书操作，取适量试样制备液和相应浓度的标准工作液，作单点或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。
　　1.3.4 确证
    对检出氢化可的松的样品，必须用重叠色谱分析来确证。以试样提取液中加入适量的氢化可的松标准工作液，加入的量应与提取液中的氢化可的松的量相当。
　　依次注入样品的提取液、氢化可的松标准工作液和添加了氢化可的松标准工作液的样品提取液。如果添加氢化可的松标准工作液的样品提取液样品所产生峰的半峰宽变化不大于10%，且峰高或峰面积发生了成比例的变化，则可确证原氢化可的松峰就是氢化可的松。
　　1.3.5 结果计算与表述
　　试样中氢化可的松的含量按式计算：
    X=m1/m*n
　　式中：X——试样中氢化可的松的含量（mg/kg）；
      m1——HPLC试样色谱峰对应的氢化可的松的质量（μg）；
      m——试样质量（g）；
      n——稀释倍数。

　　2 结果与讨论
　　2.1 提取净化条件的确定
    提取净化条件主要指提取剂与提取方法的确定，并对提取液进行净化以除去可能会干扰争谱分离的饲料基质中的杂质的方法的确定。目前国内外使用最广的提取剂有甲醇、乙腈和乙酸乙脂等，分析氢化可的松的结构和理化性质，我们采用了甲醇作提取剂，振荡的方法进行提取，添加回收试验取得了较好效果。由于我们采用了高效液相色谱检测法进行测定，通过对流动相的调查，使干扰物质与氢化可的松得到了较好的分离，因此不用进一步净化即可直接进行高效液相色谱测定，大大简化了分析步骤。

2.2 HPLC分离测定条件与实验参数的确定
    目前国内外反相高效液相色谱应用较多的流动相是水和乙腈或甲醇的混合液，当我们使用水、甲醇（75/25,v/v）作为流动相时，氢化可的松的峰形有些拖尾，我们用乙腈代替甲醇时，峰形得到改善，最后确定流动相为水、乙腈（75/25,v/v），不仅能取得很好的分离效果，而且氢化可的松的保留时间控制在约10min左右，也较为理想。
    在上述色谱条件下，测得氢化可的松标准溶液的色谱峰保留时间在10.0min附近，色谱峰峰形较好，灵敏度较高，谱图如图1。

　　3 结论
　　3.1 方法的检测限
　　我们在饲料药物检测中添加标样，通过提取、净化和仪器分离后测定的检测限，按2倍噪音量的信号为准，测得该方法的检测限为0.05mg/kg。
　　3.2 方法的线性响应    　　在上述色谱条件下，将标准工作液依次从低浓度到高浓度进样，每一浓度进样3针，按其所得峰面积的平均值与对应的标准溶液浓度（μg/ml）作标准曲线测得氢化可的松浓度在1.0～25μg/ml范围内，其线性回归方程相关系数r=0.999 6，其线性响应范围完全满足测定的要求。
　　3.3 方法的准确度、精密度与适用范围
    为考察方法的准确度、精密度数据与适用范围，分别以未添加氢化可的松的空白猪配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料为样品，进行了氢化可的松的添加回收试验。设计5mg/kg、25mg/kg、75mg/kg、125mg/kg4个添加水平，浓缩饲料和添加剂预混合饲料分别设4个添加水平，每个水平作3个重复，测得的添加回收率及结果的变异系数见表1。

　　从表中试验数据结果可以看出，本方法不仅有较高的添加回收率（平均91.8%）和较好的精密度（平均变异系数为6.11%），而且能适合不同种类饲料中氢化可的松的测定；另外，从空白饲料样品的色谱图和添加饲料样品的色谱图（见图2）可以看出，氢化可的松色谱峰附近没有杂质峰，说明饲料中的杂质对本测定方法没有干扰。

　　本方法进行了验证实验结果表明本方法的再现性，回收率高，符合要求。

　　参考文献（略）