50多年前研究者(Stokstad 等,1949)发现,饲喂金霉素(aureomycin ,chlortetracycline)对家禽生长具有促进作用,由此揭开了抗生素促生长作用的研究.人们最初将金霉素的生长促进作用归功于金霉素中所含维生素B12的发酵作用(试验鸡日粮中没有B12),但后来研究发现这种作用与维生素B12的营养作用无关(Stockstad 等1949).抗生素生长促进作用的商业重要性立即引起了人们的关注,随后几年所做的研究发现,抗生素的这种作用在猪和小牛身上表现更为明显.1949年金霉素开始商业化生产，其后众多别的抗生素产品面世并且以生长促进剂用于畜禽生产，以提高畜禽的生长效率（Jukes，1997）。不同种类的抗生素的结构不同，杀菌机制也有差别，包括破坏细菌细胞膜、调节代谢和抑制微生物细胞壁、蛋白质、DNA合成等。然而，所有饲抗生素对猪生长和饲养效率的改善作用都很相似，困此其生长促进机制明显与其抗微生物作用模式无关（Lawrence, 1998）。尽管抗生素的生长促进作用不容置疑，然而它们提高动物生长的机制还比较模糊。抗生素的这种促进作用可能是因为它诱导肠道微生物群发生了变化，在以下综述中我们归纳了与这种可能性有关的作用模式，并且对可供深入研究动物肠道微生物和动物生长效率之间相互作用的新型分子生物学技术进行了介绍。 1 抗生素对生长效率的提高作用 有充分的证据表明，饲喂抗生素提高动物生长效率具有经济效益。Hays（1991）总结了抗生素对于主要的几种动物的生长率和饲料利用率的改善作用。统计数据表明，抗生素在小猪上的应用效果要好于大大猪。数据也显示，抗生素对增重的提高作用优于对饲料利用率的提高作用，表明饲喂抗生素后动物的采食量增加。然而有研究证明，在采食量恒定的情况下，抗生生素对增重和饲料效率也有提高作用（Jones和Tarrant，1982），证明抗生素对动物生长具有直接促进作用。 饲喂抗生素引起的生长率提高可能与其对蛋白质代谢的相应改善作用有关。Weldaon(1997)对几个试验的数据进行统计后证明，猪的泰乐菌素饲喂量从1×10-5提高到5×10-5后,氮表观消化率提高3.0%,氮储留量增加5.8%,氮排出量减少10%.研究表明,促生长抗生素有利于改善机体蛋白质代谢而与日粮中的蛋白质浓度无关(Roth和Krirchgessner,1993)。体外研究表明，生长猪添加抗生素后，肌肉细胞增殖加强，蛋白质更新率下降（Hathaway等，1990a,b）。Hathaway等（1996）研究证明,饲喂ASP-250(金霉素1×10-4,碘胺二甲基嘧啶1×10-4，青霉素5×10-5)后,仔猪血清中的类胰岛素类生长因子(IGF-I)增多,并且提出,这种增多可能与抗生素的促进生长作用有关.许多研究都表明,外源性的IGF-I对动物具有生长促进作用(Nilsson等,1994)。 促生长抗生素的可能作用机制应该与其对动物生长、饲养效率、氮代谢和对幼龄动物的特殊作用相一致。下面就是对抗生素介导生长提高作用的这些具体细节进行的讨论。 ２ 抗生素促进生长作用的可能机制 关于抗生素促生长作用机制的研究大部分都是在20世纪80年代中期以前的。在这方面做过比较完整综述的有Francois（1962）、Visek(1978)和抗微生物饲料添加剂委员会（CAFA）(1997)的一项报道。这些综述的共同点是都认为抗生素通过下面四个可能的作用机制促进了动物的生长：（１）抑制动物亚临床感染；（２）减少具有生长抑制作用的微生物代谢物；（３）降低微生物对养分的利用；（４）使动物肠壁变薄，提高养分的吸收和利用（Visek，1998）。 大量证据表明，促生长抗生素对动物肠道微生物数量或活动具有调节作用（Visek,1978）。例如无菌动物饲喂抗生素无生长促进作用（Coates 等，1963）,而无菌动物从正常动物身上接种胃肠道细菌后则引起生长抑制(Coates,1980)；传统的饲养于卫生条件比较差的环境中的动物饲喂抗生素后，生长性能提高比较明显（Hays，1969;Roura等,1992）。抗生素促进生长最有可能的机制情节如下：动物肠道 中寄居有一种或几种微生物，这些微生物虽然不一定都有致病性，但却能抑制动物的生长；日粮中添加抗生素后，这些微生物受到代谢抑制或清除，它们的作用消失，动物生长加快（Coates,1980）。在鸡身上所做的研究支持这一假说。研究表明，无菌鸡肠道接种Ｇ+、兼性厌氧粪球虫菌后引起了生长抑制（Fuller等，1979）；饲喂抗生素青霉素后，不利作用得到消除（Fuller，等，1983）。所有这些数据表明，饲喂抗生素与其说是促进了动物生长，还不如说是促进了动物的生长性能正常发挥。 本综述通过讨论猪小肠内原生微生物的生长抑制作用，强调了抗生素的生长允许概念。小肠内原生微生物生长抑制作用主要机理有：（１）与宿主竞争养分；（２）产生微生物代谢产物，使肠道黏膜代谢加快，从而降低了生长效率。饲喂抗生素可以提高养分利用率，降低胃肠道系统维持消耗，进而消除由微生物引起的生长抑制。我们也讨论了使用新型分子生物技术鉴定猪胃肠道微生物菌群的必要性以及抗生素对局部肠道菌群的作用。 3 肠道细菌产生的生长抑制代谢物 3.1 酚/芳香族类复合物 酪氨酸和色氨酸在肠道中被细菌降解时会产生具有强烈毒性的酚类和芳香族类复合物，如苯酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、吲哚和3-甲基吲哚(粪臭素)等，这些物质都通过尿液排出(Deichmann和Witherup,1943)。无菌老鼠体内和尿液内没有这些酚类复合物(Bakke和Midtvedt,1970)。一般认为，人类食物中的蛋白质增多会引起粪中的氨、挥发性含硫物质以及尿中的4-甲基苯酚增多(Geypens等，1997)。然而个体禁食时，尽管没有任何的营养摄入，尿中苯酚和4-甲基苯酚的数量也没有发生变化(Bures等，1990)。因此，尿中苯酚和4-甲基苯酚的排泄量不仅仅依赖于食物中的蛋白质含量，更有可能反映的是肠道细菌产生的内源性物质的代谢情况。断奶仔猪尿中的4-甲基苯酚浓度与体增重之间呈负相关(r=-0.73)，表明微生物产生的4-甲基苯酚可能会抑制动物生长(Yokayama等，1982。饲喂ASP-250后，粪和尿中的酚类和芳香族类复合物(尤其是4-甲基苯酚)排泄量减少(Yokayama等，1982。老鼠饲喂含有10%酪氨酸的蔗糖日粮时，挥发性苯酚的排泄量增多会对体增重产生副作用，通过饲喂金霉素则可以消除这种不利作用(Bernhart和Zilliken，l958)。因此，降低细菌产生的酚类复合物可能是支持抗生素生长促进作用的潜在机制之一。 3.2 氨 氨是氨基酸被微生物脱氨基和尿素被脲酶水解时产生的有毒废物(Visek，1981,1984)。人小肠内的细菌跟酶活动很普遍(Suzuki等，1979)。在猪身上没有做过具体研究。普通动物结肠内的氨气浓度是能够引起细胞损害浓度的好几倍(Visek，1978)，表明肠道尿素酶产生的氨气对于氨气的自然浓度具有显著的生物学作用。有证据表明，微生物产生的尿素酶以及由此引起的高浓度氨气对动物的生长有害。例如，无菌动物不发生尿素水解(Lvenson等，1959)，肛门氨气浓度仅是普通对照组的25%(Warren和Newton,l959)。老鼠和鸡尿素酶免疫后，与不免疫的对照组相比，体外脲酶活力下降，肠道氨气浓度降低，生长加快(Dang和Visek,l960)。猪饲喂具有氨气吸收作用的离子交换树脂后，生长性能提高(Pond和Yen,1987;Veldmen和Vander Aar，1997)。Visek(1978)指出，降低微生物产生氨气能力是饲用抗生素引起生长促进反应的主要机制。 3.3 胆汁酸的生物转化 Feighner和Dashkevicz(1987，1988)指出，抗生素促生长的重要机制之一是抑制了肠道内微生物对胆汁酸的生物转化。肠道微生物对胆汁酸的解离和去羟基化作用会削弱宿主动物对脂肪的吸收(DeSomer等，1963；Eyssen，1973)，产生抑制动物生长的有毒产物(Eyssen和Desomer，1963a)。胆汁酸在无菌动物肠道内不发生解离，证明肠道细菌在胆汁酸解离过程中起着重要作用(Madsen等，1976)。尽管别的一些细菌，如类菌体、双歧杆菌和梭状芽孢杆菌等(Kawamoto等，1989；Stellwag和Hylemon,1976;Grill等，l995；Gopalsrivastava和Hylemon,1988)，具有胆汁盐水解活力，但主要起水解作用的是寄居于小肠内的乳杆菌。去除老鼠肠道微生物菌群中的乳杆菌，理想的胆盐水解活力下降86%;去除乳杆菌和肠球菌素，胆盐水解活力下降98%以上(Tannock等，1989)。这些结果表明，乳杆菌是老鼠肠道内胆汁盐水解酶总活力的主要提供者。对于鸡而言，Eyssen和DeSomer(1963b)首先提出，肠道细菌引起的生长抑制可能与胆汁酸的转化产物有关。有证据表明，鸡肠道细菌解离胆汁酸所导致的生长抑制作用可以通过添加抗生素加以消除(Fuller等，1984)。进一步研究发现，饲喂抗生素的肉鸡，小肠内胆磺酸水解酶活力水平与动物的生长率呈负相关(FeighnerDashkevicz，1987,1988)。猪饲喂抗生素后，肠道内胆酸浓度下降，日增重和饲料效率提高，与关于家禽的报道一致(Tracy和Jensen,1987)。还需要进行深入研究来验证胆汁转化对动物生长的抑制作用。 3.4 生长抑制性细菌代谢物 能够产生以上生长抑制性细菌代谢物的肠道有机体比较多，有些已经鉴定出来，有些还有待确认。应用分子技术有望对肠道微生物的代谢活动有更加深入的了解。有必要指出的是，尽管不同种类的细菌可能会产生一种或几种上述代谢物，小肠中占主要的革兰氏兼性厌氧菌却经常能产生所有的这三种毒素。这种现象有助于解释为什么使用抗生素减少某些菌群数量或调整菌群代谢能够促进动物生长。解释特定细菌产生特定代谢产物的数据来源于培养基制作方法，因此应该谨慎对待。考虑到胃肠道细菌中只有10%～50%能够在培养基上定植生长，目前培养的细菌是否在其自然过程中起主要作用值得怀疑，它们可能仅仅代表着自然数量的一小部分。结合系统发育和功能分子方法直接定性原位菌群，可以更好地解决这个问题。 令人奇怪的是，有些看来能抑制动物生长的有机体，即革兰氏兼性厌氧菌，包括乳杆菌和肠道球菌，也常被用来作为微生态制剂(益生菌)中的有机物，用于提高畜禽健康和促进动物生长(Jonsson和Conway,l992)。益生菌和抗生素对畜禽的促生长作用机制不一样(Jonsson和Conway,l992)。人和动物补充某些益生菌可以有效防止肠道致腹泻病原菌致病(McCracjen和Gaskins,1998)。因此，益生菌可在某些病原菌存在的情况下促进生长，而同样的有机物在干净卫生的环境下通过上述代谢机制则会抑制动物生长。 4 肠道微生物与宿主在小肠中的竞争和在大肠中协同 我们目前关于宿主-细菌相互作用的知识，无一例外的来自于体外培养研究。这些方法有一定的缺陷，但是直到最近为止，它们仍是微生物学家的唯一工具。培养研究表明，小肠中的微生物活动与宿主存在着能量和氨基酸的竞争(Hedde和Lindsey，1986)。例如细菌利用葡萄糖生成乳酸，减少了宿主动物可以利用的能量(Saunders和Sillery,1982）。乳酸也能加速小肠蠕动，提高营养物质通过肠道的速率(Saunders和Sillery，1982)。由于小肠内细菌对葡萄糖的利用，猪日粮中的净能损失可达6%(Vervaeke等，1979)。氨基酸被小肠细菌降解后，就不能被猪利用了，并且会产生氨、尸胺、4-甲基苯酚等有毒代谢物。尽管盲肠和结肠中的微生物活动与宿主存在协同作用(Hedde和Lindsay，1986)，估计猪总能中有5%～20%来自于肠道后段细菌的发酵作用(Friend等，1963);然而小肠是营养和能量的主要吸收部位，并且小肠中的细菌量要比大肠中小好几个数量级(Stewart，1996)。因此我们认为，抗生素的生长促进作用源于小肠内菌群的大量减少以及由此引起的小肠上皮功能改变;而大肠微生物数量的变化对动物生长的影响甚微。大部分的促生长抗生素是针对革兰氏阳性菌的，而小肠中占主要地位的细菌就是革兰氏阳性菌(Stewart，1996)，这也可以作为这一假说的支持证据之一。有关胃肠道菌群空间分布的数据都是通过培养方法得来的，肯定存在偏差。我们认为，新兴的分子技术将会对胃肠道菌群空间分布和分类成分影响动物生长的说法做出更加清楚的评价。 5 消化道细菌和肠道炎症 肠道细菌在肠道免疫系统的发育过程中起着重要作用(Gaskins,1996)。消化道细菌的这种致免疫作用在无菌动物消化道免疫系统尚未成熟时最易观察到，这时肠道淋巴组织不健全，淋巴细胞(B和T-细胞)很少，抗体浓度较低(Wostmann，1996)。无菌动物接种整套肠道细菌后，这些免疫参数进入正常状态(Carter和Pollard，1971)。研究无菌动物接种个别细菌或已知细菌组时发现，不同种类细菌的致免疫作用不同，有的很强，有的中等，有的很弱甚至没有致免疫作用(McCracjen和Gaskins,l999)。很明显，细菌刺激肠道免疫系统发育对于动物的保护性免疫非常重要。然而，促生长抗生素发挥作用的潜在机制之一是减少寄居在小肠内的致免疫性细菌。通过限制小肠细菌生长，促生长抗生素可以降低普通动物胃肠道本身的低水平感染，从而降低与此有关的能量消耗。因此饲养环境将会影响到动物局部感染消耗和免疫完整必要性之间是否收支相抵。Stahly等(1995)研究了泰乐菌素对于常规断奶仔猪和药物治疗断奶仔猪的生长速率、饲养效率和胴体组成的影响。他们确定，饲喂泰乐菌素能够提高增重、增加体蛋白和降低体脂肪，但常规断奶组反应幅度最大，或许是因为受致免疫原刺激较大的原因。Roura等(1992)研究了肉鸡免疫活力状态与抗生素生长允许能力之间的关系。他们提供的数据与下面的假设一致，即通过饲喂抗生素预防致免疫原应激和由细胞因子引起的代谢变化，可以使动物的生长性能得到正常发挥。 6 细茵对消化道代谢和维持能量需要的改变作用 一般消化道细菌的存在会使消化道壁变厚，肠道重量增加、吸收能力下降，并且使黏膜细胞代谢更新率加快(Commission on Antimicrobial Feed Additives, 1997)。这些作用的原因不明，但可能与宿主对细菌性抗原以及上面所提到的代谢产物的反应有关。在无菌动物身上做的研究表明，饲喂抗生素可以降低或者防止这些不利作用。无菌动物和一般动物的最明显区别就是，无菌动物小肠壁较薄、联系组织和淋巴组分少(Coates,1980)。在显微镜下观察无菌动物肠道可发现，其绒毛结构更加规则、细长，基底层较薄。并且无菌动物肠道上皮细胞的代谢更新率较慢，可能更有利于减少营养利用中的基本能量消耗，提高能量利用率。这些观察与Reeds等(1993)的观点一致，他们认为，在快速生长的幼铃动物中，胃肠道和骨骼的肌肉组织在营养沉积过程中存在竞争作用。 SPF猪的维持能量低于常规饲养的同窝猪(Verstegen等，1981;)。研究用的小猪通过子宫切开术得到。每窝小猪一半运到商业养猪场中由代育猪代养，一半保持在无菌环境中，以期引起消化道菌群的早期不同。10～12周时，各组动物都转运到单独的呼吸室中，饲养至大约105kg。试验猪彼此隔离，环境高度卫生，进风用紫外线处理，饲料进行辐射。体重为105kg时，SPF猪的消化道空重(2872：3003g)、大肠肠系膜淋巴结重量(51：84)都比对照组低。SPF猪的维持能量需要少，与消化道正常微生物影响维持能量需要的假设相一致，并且即使在高度卫生的环境中，这种作用也可能延续到生长育肥阶段。 7 肠道微生态研究新技术 直到最近为止，消化道微生态研究还是容易受到培养基计数和定性内在局限性的制约。DNA和RNA技术的发展可以不用培养方法进行菌群鉴定和计数(Mackie等，1998)，因此可以对猪胃肠道微生态系统和促生长抗生素对于胃肠道菌群的改变作用进行重新评估。例如利用既包含高度固定区域也有一定可变区域的16SrRNA分子，不但可以定性混合菌群中的细菌种属，也可以确立不同种属细菌之间系统发育的关系。McCracken等(研究但未正式发表)用16SrRNA研究分析了微生物种群与抗生素对肠道细菌的作用。选取17周龄的老鼠，饲喂试验标准日粮，饮水中无抗生素或加有25×10A-5的头孢噻吩。抗生素处理后第7d采集粪样，从粪样中去除DNA，利用编码16SrRNA的固定16SDNA分子的引物进行PCR序列分析。由于PCR引物与细菌中的固定序列相对应，所以PCR产物大致代表了粪样中的所有细菌种类。然而细菌种属间的插入DNA序列变化较大，不同的序列可以用变性剂梯度凝胶电泳法(DGGE)(Muyzer等，1996)通过G+C核苷酸分析加以分离，这种方法中聚丙烯酰胺凝胶中使用的DNA变性剂尿素和甲酰胺的浓度是线性增加的。最终结果证明，这种方法有助于观察抗生素诱导肠道微生物菌群发生的变化。可以用影象分析系统对个体频带强度进行相关分析。最后可以将个体频带从凝胶中分离、克隆、延长，对它们的出现、消失或使用抗生素后的强度变化进行鉴定。传统上利用的特异性16SrRNA探针膜杂交方法使细菌个体种类或种属的鉴定成为可能。 8 结 语 抗生素有益作用的准确机制尚不清楚。有人提出消化道近端的促生长抗生素通过调整消化道的小微生物群落提高了动物肠道以及动物整体的生长效率。过去的40多年中，有关猪生长的研究主要是直接通过改变肌肉和脂肪代谢来影响生长、饲料效率和胴体组成。为正确评价正常消化道菌群在动物生长中的作用，有必要正确理解消化道生理学、微生物学和免疫学之间的相互关系，以及它们对于猪生长的作用。鉴于此，现在可用的分子技术就更加让人兴奋了，因为它可以使我们更好的理解使用抗生素对于消化道微生物分布的影响。这些进展促进了新兴技术、管理系统和营养调控的发展，这些发展成果应用到动物生产中则有助于优化动物消化道健康和促进动物生长。
