铜对猪原代培养肝细胞中铜蓝蛋白酶活性的影响

来源: 作者: 时间: 2006-08-01

铜是人类和动物机体必需的微量元素之一。铜不仅参与动物体内蛋白质、氨基酸、核酸、脂肪、碳水化合物、维生素等营养物质的代谢,而且还在骨骼发育、生殖、免疫、凝血、生物膜稳定等生理机能中担负着重要作用。

高铜对猪的促生长效应，一直是动物营养界的一大热门研究领域。肝脏是动物体内第二大消化器官，在机体的营养代谢过程中起着重要作用。被誉为“物质代谢中枢”。已知肝脏所分泌的酶有数百种以上，其中与铜密切相关的含铜酶主要有铜蓝蛋白（cerulo plasmin,CP）和铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)等等。

微量元素铜不仅参与动物体内造血过程，而且也是多种酶的组成成分，对维护动物正常生理机能至关重要, 血浆铜蓝蛋白是血浆中最丰富的含铜蛋白，其络合血浆70%～95%的铜，每个分子在不同位点共结合6-7个铜原子，将铜传递给细胞和细胞内蛋白质。铜蓝蛋白(CP)是一种具有抗氧化性、能强有力地抑制脂类自身氧化、清除体内自由基的蛋白。肝脏是合成CP的主要器官，CP主要由肝细胞合成并分泌进入血液，被输送到全身组织发挥各种生理功能。

本实验通过向体外培养的肝细胞模型中添加铜，观察其对肝细胞中铜蓝蛋白酶活性的影响情况，寻求铜促生长与基因表达的内在联系，为进一步阐明铜的促生长的机理提供理论和实验依据寻求铜促生长与含铜酶的内在联系，为进一步阐明铜的促生长的机理提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

选用初生1-3d日龄 “军牧1号” 健康仔猪，作为肝细胞供体，雌雄不限，体重0.5-1.0kg。由吉林大学农学部动物繁育中心种猪场提供。

1.1.2 试剂

细胞培养试剂:Ⅳ型胶原酶（collagenase typeⅣ）、胰蛋白酶（1：250）、D-Hanks

RPMI1640综合培养基购自Gibco公司；新生牛血清（NBS）、台盼蓝为Sigma公司产品，

乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、青、链霉素等为国产常规试剂。

添加试剂： CuSO₄·5H₂O为国产分析纯。

酶活性检测试剂：铜蓝蛋白（CP）测定试剂盒由南京建成生物工程公司生产。

1.1.3 仪器

MCO-17AI型CO₂培养箱(日本,SANYO公司)；

CQIC型倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；

SW-CJ-IF型超净工作台；

AEG-120型电子天平；

6孔、12孔、24孔细胞培养板（丹麦NUCO公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 原代肝细胞的分离

将仔猪颈动脉放血处死，在无菌间中腹部消毒，采用外科手术留取肝组织10-15g，放入20ml 4℃预冷D-Hanks 缓冲液内，迅速送入超净工作台。4℃预冷D-Hanks反复冲洗3次，置于另一新的平皿中，用眼科剪剪成2 mm³左右的组织块,缓冲液冲洗2-3次，去除大量红细胞等杂质，加入1%的胶原酶Ⅳ5ml在培养箱中消化15-20min，弃消化液，缓冲液冲洗后，反复轻轻吹打，吸取细胞悬液，将细胞悬液经过45μm滤网过滤2次，离心收集细胞，加入含10%新生牛血清的RPMI1640细胞培养液。取混匀的细胞培养液1滴，台盼蓝染色，镜下观察计算细胞总数和细胞存活率。

1.2.2 肝细胞培养液中添加铜的试验

肝细胞的条件培养液组成：在含10%血清细胞基础培养液中，加入配制的不同浓度的铜添加液。每0.95mL培养液，加入对应浓度的铜添加液50μL，使铜的终浓度为0、15.6、31.2、46.8、62.4、78.0、93.6μmol/L 。标记为对照组（0）和试验（A-F）组（依浓度由低到高顺序）。对照组为含10%血清细胞基础培养液。

待细胞贴壁良好、长满单层，达到实验要求即可开始实验。首先，吸出基础培养液，用无血清培养液冲洗3次，每孔加入相应浓度含10%血清的不同铜浓度的条件培养液1.0ml。每孔为一个处理，每组设3个重复(孔)。按计划时间收取细胞培养液，每孔1.0mL，分装到高压灭菌1.5mL离心管中，-80℃保存待检。

1.2.3 铜蓝蛋白(CP)的测定

用邻联大茴香胺法（南京建成生物工程公司试剂盒）。其测定原理是：CP催化联大茴香胺转变成淡黄棕色产物，加终止剂后形成紫红色溶液在540nm测定吸光度，根据产物的吸光系数可计算酶的活力。测试过程按试剂盒说明进行操作。

1.3 统计分析

试验数据用X±S表示，用SPSS10.0软件进行数据分析，并用ANOVA（方差分析）分析方法进行差异显著性检验。

2 结果

2.1 猪肝细胞产率及活率

应用剪切消化法分离细胞，按台盼蓝排除法测定,平均每克猪肝能获得8.1×10⁷个肝细胞。获得的肝细胞即时存活率平均可达93.4%，培养存活率平均可达87.6%。

2.2 铜水平对细胞培养液铜蓝蛋白（CP）活性的影响

结果见表1。细胞培养液中添加铜后,与C 组和 D组CP活性显著高于对照组(p<0.05)，A组和B组、F组与对照组差异不显著，E组与各组差异不显著。从图1铜蓝蛋白的变化趋势来看，CP对于低浓度的铜反应不明显，随铜浓度的增加其活性亦升高，浓度过高，其活性受抑制而呈降低趋势。

表1 铜对肝细胞铜蓝蛋白活性的影响

组别铜浓度 μmol/L 铜蓝蛋白（CP）（U/L）

O 0 3.00±0.18^b

A 15.6 2.79±0.49^b

B 31.2 3.12±0.18^b

C 46.8 4.19±0.34^a

D 62.4 4.30±0.09^a

E 78.0 3.66±0.39^ab

F 93.6 2.43±0.79^b

注：同一列标有不同小写字母表示差异显著p＜0.05；同一列标有不同大写字母表示差异极显著p＜0.01；

3 讨论

3.1原代肝细胞供体的选择

在肝细胞供体的选择上，成年肝、新生动物肝和胎肝均有采用。本研究证实，成年猪肝脏组织连接多而紧密，分离困难，致使许多肝细胞受损，且酶消化时易发生组织块周围细胞过度消化，而组织块中心的细胞尚未分离，因此，获得的肝细胞不易成活；选用胎猪时又有肝脏体积小，细胞未分化，成纤维细胞容易大量增生，实验成本高等不足之处。新生仔猪的肝组织易分离，细胞分化、新生能力强，新陈代谢旺盛，容易成活，肝组织体积能够完全满足试验需要。因此本试验选用出生1～3d的新生仔猪作为肝细胞供体。

3.3 体外培养原代肝细胞模型的建立

根据肝细胞是否传代培养而分为原代肝细胞和传代肝细胞株。目前, 多采用原代肝细胞培养技术，主要原因是原代肝细胞在一定条件下在几天内，还具有体内肝细胞的一些功能及活性, 增加了原代肝细胞的研究价值，故本试验采用体外培养的原代肝细胞作为试验对象。

肝细胞在体内具有巨大的增殖潜能，可进行多次细胞分裂。但肝细胞在体外增殖能力差。原代肝细胞仅能在1～2wk内维持肝细胞的形态，具有良好的合成和分泌功能，之后便逐渐退化死亡。据报道^[3]分离后大鼠的肝细胞的白蛋白及总蛋白的合成能力保持较高水平的时间可达10d左右。反映肝细胞再生能力的甲胎蛋白的合成高峰在培养的第3～7d之后逐渐下降。本试验也发现猪原代肝细胞增殖能力在培养的第1～2d，处于从机械损伤和酶消化损伤的恢复阶段及适应新环境阶段，第3～5d处于上升阶段，之后处于平稳维持阶段。随着离体时间的延长，肝细胞的状态变化越大。因此本试验选择培养1～7d的猪原代肝细胞作为体外培养模型的研究阶段，在此期间采取观测样品,肝细胞活性和功能良好，比较接近体内状态。

3.4 铜对肝细胞铜蓝蛋白活性的影响

铜蓝蛋白是存在于人类及脊椎动物的唯一的多铜氧化酶, 是一种丰富的血清α₂-糖蛋白，分子量大约132KD，属于多核铜蓝氧化酶家族, 血清铜蓝蛋白是一种抗氧化剂, 它能清除体内的超氧化物自由基,在维持机体内环境的平衡及保障机体正常功能等方面均有十分重要的意义。

有资料表明，CP的升高与下列情况有关，当体内各种代谢功能增强，肝脏合成代谢加速，释放的CP增多，故CP水平就升高；另外当体内各种生物合成加速时而需要大量ATP。ATP的产生又需要细胞色素氧化酶的催化，且铜为细胞色素氧化酶所必需，其浓度与氧化酶的活性及血清铜的含量有平行关系，所以当合成加速时，不仅需要大量的ATP提供能量，而且需要大量的细胞色素氧化酶参与，因此，机体CP含量就会升高。故肝细胞CP活性的高低于机体的合成代谢存在着内在的联系。

本实验结果显示，在细胞培养液中添加不同浓度的铜，能够在一定程度上提高CP的活性，但当铜浓度过高时，CP活性则呈下降趋势。这与铜促生长现象相吻合，低浓度的铜没有促生长作用，125～250mg/kg的铜有明显促生长作用，超过这个限度则产生铜中毒现象。据此认为，较高浓度的铜可能是通过提高铜蓝蛋白酶的活性来加速体内生物合成，参与动物的生长过程的。

综上所述，通过试验，使我们明确的认识到肝细胞中含铜酶CP水平的变化与铜的添加有着一定联系，表明铜的浓度改变导致铜蓝蛋白的活性改变，与动物体内的生理、生化代谢过程有着密切的关系，为探究高铜促生长机理提供实验依据。

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