1 抗菌肽与LfcinB的发现
抗菌肽是宿主防御系统产生的一类对抗外界病原体感染的肽类物质，是宿主免疫防御系统的重要组成部分（Papagianni，2003）。抗菌肽抗菌广谱，对病毒、寄生虫、癌细胞均有抑制作用。天然的抗菌肽通常是由十几个至几十个氨基酸残基组成的小分子多肽，多小于10 kDa，含多个带正电荷的氨基酸如赖氨酸（Lys）或精氨酸（Arg），多数抗菌肽pI大于7，表现出强阳离子性，N端亲水，C端疏水具有双亲性，水溶性和热稳定性好，对高离子强度和pH值均具有较强的抗性。此外部分抗菌肽具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力，例如牛乳铁蛋白肽Bovine Lactoferricin。抗菌肽由基因编码、核糖体合成（Reddy等，2004），或由大分子功能蛋白降解形成。
Boman小组首次通过对滞育的天蚕Hyalophora cecropia蛹注入Escherichia coli，诱导蚕蛹血淋巴分离出两种低分子量的具有极强抗菌活性的肽类物质（Hultmark等，1980）。后霍夫曼等证实了这些肽的存在，先用细菌培养液注射昆虫，12h～24h后昆虫产生了大量的肽类抗菌物。Steiner等在Nature上公布了该类肽的一级结构并正式命名为天蚕素 Cecropins（Steiner等，1981）。迄今，已从动物不同组织中分离并鉴定出100多种抗菌肽。
前面提到的乳铁蛋白活性多肽（Lactoferricin，简写为Lfcin）是15年前发现的一种新型抗菌肽。Lfcin具有多种生理活性，是乳铁蛋白活性中心，具有抑菌杀菌、抗癌、调节免疫、抗病毒等多种乳铁蛋白所具有的生物学功能。Abe等(1991)在研究酸性条件下乳铁蛋白（LF）的热稳定性时发现，经热处理后LF发生明显的降解，但抑菌活性却强于未经热处理的LF，于是推测在LF加热降解后产生了抑菌活性强于LF的多肽。Tomita等（1991）研究了牛LF经蛋白酶降解后产生的多肽的抗菌作用，结果表明，猪胰蛋白酶水解所得小分子多肽抗菌活性显著提高，具有广谱抗菌活性，能抑制多种 G+和G-细菌生长，其中包括对LF具有抗性的菌株，且迄今未发现病原菌对其耐药性的报道。Bellamy等（1992a）在牛LF的胃蛋白酶解产物中分离得到一段N端多肽，其抗菌活性比LF强400多倍，将其命名为Lactoferricin（简写为Lfcin），此后，相继在人、小鼠、山羊和猪（Strom等，2002）等动物LF中发现Lfcin同源物。其中，由于牛Lfcin（LfcinB）抗菌活性最强而成为研究热点。LfcinB来源于牛乳铁蛋白的17-41位AA，由25个AA残基组成，AA顺序为Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met- Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe（Bellamy等， 1992b）。作者小组近几年对Lfcin的作用机制（冯兴军等，2004）、融合表达研究（Feng等，2005；田子罡，2006）以及包含有此新型抗菌肽在内的肽类抗生素的转基因表达策略探讨（冯兴军等，2006）分别有专门报道或论述。
2 LfcinB生物学功能
2.1 抑菌与杀菌
Lfcin抗菌广谱，包括许多G+和G-病原菌，例如大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等，与牛乳铁蛋白相比， LfcinB的抗菌活性提高了400多倍（Bellamy等，1992b）。除对原核细胞作用外，LfcinB对真核微生物如霉菌、酵母也具有抑制作用。实验表明，LfcinB及其衍生物能够抑制培养基中毛癣菌（Trichophyton）、白色念球菌(Candida albicans) 等真菌病原体的繁殖，抑制其菌丝生长，口服LfcinB能够改善动物感染毛癣菌病状，缩短治愈时间（Wakabayashi等，1999b；2000）。 LfcinB对包括真菌在内的微生物均有抑制作用，除个别G+外，生长在1%蛋白胨培养基或Sabouraud葡萄糖培养基的真菌、G+和G-在较低 LfcinB浓度下不能生长，MIC为10μg/ml左右（唐传核等，2000）。Bellamy等（1992b）研究了28种菌株对LfcinB的敏感性，所选待测菌株包括G+和G-、杆菌和球菌、专性需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌，测定了在蛋白胨基础培养基(细菌蛋白胨10 g/l)和YPG培养基(细菌蛋白胨10 g/L；酵母浸膏0.5 g/l；葡萄糖10 g/l)上LfcinB的有效抑菌质量浓度，结果表明，随菌株和培养基变化，有效抑菌质量浓度范围为0.6～150 μg/mL，并发现G+对LfcinB比G-更为敏感。
Lfcin抗菌活性受多种因素影响。Lfcin属阳离子型抗菌肽，靠静电作用与微生物质膜结合，在这一过程中离子性反应起着至关重要的作用。因此，影响 Lfcin与质膜间离子性反应的因素就可能影响Lfcin的抗菌活性，例如提高溶液中Ca2+、Mg2+等阳离子的离子强度、增加Tris、Hepes、 PIPES缓冲液浓度，都会显著降低Lfcin抗菌效果。此外，培养基、菌株不同对Lfcin的抗菌活性也有一定影响（Bellamy等，1992b；许时婴等，2001）。
2.2 抗寄生虫
Turchany等（1995）研究发现，LfcinB和LfcinH能够抑制贾第鞭毛虫的生长，杀死培养基中的贾第鞭毛虫。与LF相比，虽然 LfcinB和LfcinH不能与Fe 3+结合，但Fe3+能够减弱LfcinB和LfcinH对贾第鞭毛虫的抑制作用；Turchany等（1997）通过进一步研究证实，Fe 3+能够抑制LF或Lfcin与贾第鞭毛虫的结合，表明Lfcin对贾第鞭毛虫的抑制作用不仅与贾第鞭毛虫的铁利用有关。
Tanaka等（1995）研究发现LfcinB对体外环境下的鼠弓形体（Toxoplasm gondii）具抑制作用。Omata等（2001）进一步实验发现，小鼠胚胎细胞与经LfcinB处理后弓形体的孢子共同培养，细胞存活率显著高于对照组；此外，将LfcinB处理的兔肝艾美尔球菌（Eimeria stiedai）的合子感染体外培养的兔肝脏细胞，也得到了相同的结果。实验表明，LfcinB可有效减弱弓形体、兔肝艾美尔球菌等病原虫对宿主细胞的感染力。对于感染弓形体的小鼠，每天饲喂5.0 mg或皮下注射0.1 mg LfcinB实验组小鼠无一死亡，而对照组死亡率达80%，同时，两处理组小鼠脑组织中感染的寄生虫量也明显低于对照组，结果表明LfcinB能有效抵制弓形体对小鼠的侵染。
2.3 抗病毒
LfcinB可降低细胞巨化病毒和HIV（Berkhout等，2002）、疱疹1型和2型病毒（Jenssen等，2004）、腺病毒（Di Biase等，2003）、轮状病毒（Superti等，2003）、脊髓灰质炎病毒和猫嵌杯样病毒（McCann等，2003）等对宿主细胞的感染力，抑制病毒颗粒复制，如通过结合细胞膜硫酸乙酰肝素（HS）封闭疱疹病毒的结合受体，抑制疱疹病毒对细胞的感染，通过封闭CXCR4或CCR5受体抑制 HIV对宿主细胞的吸附，最新研究认为Lfcin所带正电荷、疏水基团和环状结构等因素都与其抗病毒“吸附-封闭”机制（McCann等，2003； Anderson等，2003）有关。
2.4 抗癌
体外研究表明，LfcinB对转化细胞具有细胞毒作用，能抑制THP-1人单核白血病细胞（Yoo等，1997）、人白血病细胞HL-60（Roy等， 2002）增殖及生长发育，启动肿瘤细胞凋亡程序，增加细胞内活性氧水平，提高Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶活性，导致细胞形态异常、染色体凝集、 DNA片段化、凋亡小体等细胞凋亡特征的出现，最终杀死癌细胞。此外，研究发现，小鼠皮下注射LfcinB能够抑制黑色素瘤细胞及淋巴瘤细胞的转移（Yoo等，1998）。
2.5 调节免疫与消炎
蛋白质或多肽在初生哺乳动物消化道内可以被完整吸收并转运；在正常动物或人消化道中，酶解释放的游离氨基酸经钠泵或非钠泵吸收，二肽或三肽由特异性转运载体吸收，3肽以上的多肽很难被消化道以非特异性吸收形式进入血液。因此，口服Lfcin（25AA）能调节动物机体免疫水平分子、辅助杀死体内致病细菌、原虫或病毒（Isamida等，1998；Omata等，2001；Wakabayashi等，2000）等作用的实现方式就成为研究热点。 Davidson等（1988）报道，在小肠刷状缘细胞膜存在LF特异性结合受体，Lfcin在LF与受体结合过程中起重要作用，人们推测LF和 Lfcin可能会以受体介导形式被小肠粘膜特异性吸收，但至今未被实证。肠道淋巴细胞存在LF特异性结合受体；Lfcin能与人多形核白细胞作用，促进释放对中性粒细胞具激活作用的干扰素-8（Shinoda等，1996）。由此，LfcinB作用模式依然停留在通过与消化道免疫系统作用，增强细胞免疫反应，间接提高宿主抵抗力的观点上。
2.6 抗氧化
机体内氧自由基过剩，会造成构成细胞组织的各种物质，如脂质、糖类、蛋白质、核酸等所有的大分子物质发生各种氧化反应，引起变性、交连、断裂等氧化伤害，近而导致细胞结构和功能的破坏，以及机体组织损伤和器官病变。因此，过剩的氧自由基被认为是衰老或疾病的征兆。在通常情况下，铁等金属离子能够起到催化剂的作用，加速氧自由基的产生，乳铁蛋白能够鳌合铁离子，抑制铁引起的脂质氧化作用。与乳铁蛋白相比，虽然LfcinB不能结合铁离子，但体外研究表明， LfcinB同样能抑制铁离子的催化作用，阻断脂质体氧化，减少自由基生成（Wakabayashi等，1999）。
3 Lfcin的制备
乳铁蛋白分布广泛，在动物乳特别是牛初乳和乳清中含量丰富，是目前商用LF的主要来源，可以通过色谱法、超滤法、盐析、酸沉淀等方法制得。LfcinB可由LFB水解制得。美国专利（Tomita等，1994）利用牛LF为原料，经胃蛋白酶在酸性条件下水解后，离心，利用阳离子或疏水性亲和色谱技术分离、洗脱、脱盐、冷冻干燥制得纯度达99%以上的LfcinB，产率较其它方法有很大提高，每1000 ml亲和介质可获得3～5 g LfcinB，是生产药用Lfcin的有前途方法之一，但该方法回收率低，工艺较复杂，成本较高。
多肽化学合成技术日趋完善，利用多肽自动合成仪可以准确合成一定氨基酸顺序的多肽，该技术用于少量合成Lfcin及其多种衍生物，是研究Lfcin活性与结构的关系、明确Lfcin作用机制、调节Lfcin的功能以及开发具有特定功能与性质的Lfcin衍生物的重要方法与手段。但该方法合成的Lfcin价格十分昂贵，仅使用于实验室的小量制备。
利用基因工程生产Lfcin具有广阔的应用前景，Lfcin属于多肽，利用DNA合成仪直接合成编码Lfcin的DNA，并构建表达载体，在乳腺反应器或微生物中高效表达Lfcin具可行性。但由于Lfcin抗菌广谱，宿主表达的Lfcin可能会对微生物宿主本身产生反馈性抑制作用，达不到高效表达的理想结果；因此构建Lfcin的表达体系的同时，要考虑筛选对Lfcin具有一定抗性的宿主微生物，这虽然增加了基因工程生产Lfcin的难度，但因生物技术的迅速发展，仍不失为实现Lfcin产业化最有希望的途径之一，在此方面我们实验室做了一些有意义探索（冯兴军，2005；Feng等，2006；田子罡，2006），并首次在国际上报道了优化Lfcin基因在大肠杆菌融合表达的结果（Feng等，2006）。
4 Lfcin作为饲料添加剂的应用前景
LfcinB等抗菌肽由于自身的优良特性显示出在食品储存、饲料安全和医药产业中广泛的应用前景。Lfcin不含有稀有氨基酸和外源化学成分，是一种健康安全产品。Lfcin在动物消化道中具有良好稳定性，同时具有免疫原性小、水溶性好、广谱杀菌甚至能够杀真菌、原虫等优点，能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶的降解。Kuwata等（1998；2001）研究指出，LF在消化道中经酶解后其活性片段没有受到破坏。Lfcin具有良好的热稳定性，特别是在酸性条件下，加热甚至是高温高压处理对其抗菌活性没有影响（Tomita等，1991），因此Lfcin不仅能够耐受饲料加工过程中高温高压的剧烈条件，并且可以在饲料保存过程中持续发挥其功能，保持饲料品质，延长贮存期限。Lfcin具有广谱抗菌抑菌活性，抑制或杀死发生病变的真核细胞，且对较大的离子强度和较低或较高pH有较强的抗性，并与常规抗生素通过阻断生物大分子合成的作用机制完全不同，病原菌不易对其产生耐药性，由此显示了它独特的研究和应用价值。如利用Lfcin抑菌活性，抑制产品在加工及销售中滋生的有害细菌，延长产品货架期，同时可用于饲料中起到天然防霉防腐剂的作用，用于防止造成饲料污染的致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，以及引起饲料霉变的多种霉菌。此外，Lfcin具有多种生物学功能，在医药领域作为一种免疫增强剂已开始应用于提高机体非特异性免疫功能。由于其价格昂贵、抗菌活性还不够理想及来源问题等不利因素，限制了其在畜牧生产中的应用，因此可以由这些角度入手，着力解决提高Lfcin生产效率，降低生产成本。此外，Lfcin在动物营养中的研究还很少。因此，应加大加快这方面的研究工作，使Lfcin尽快为绿色畜牧业发展发挥其应有的作用。
