1材料与方法
ll菌株和培养基
l l 1 XYl905本实验室从南宁纸厂土壤中筛选．
1．1 2种子培养基(g/l) (NH4)2SO40.5，K2HPO4 1.0
MgSO4-7H2O O．3，CaCl2·2H2O 0．2，K2SO4 O．1，NaCl O 2，自 制玉米芯半纤维素15．DH7。
1．1 3产酶培养基(g／1)将种子培养基中的半纤维素改为稻草粉28和麸皮12．DH7。
1．2试剂
1-2．1 D一木糖(sigma)溶液10umol／ml 0．15g溶于柠 檬酸缓冲液中定容至100 m1．
1．2．2底物l％1g燕麦木聚糖(slgma)加入柠檬酸 缓冲液中磁力搅拌过夜．定容至100 tnl．
1-2 3 CtNS试剂 取酒石酸钾钠182g溶于500ml水 中，加热(不超过60℃)，在热溶液中依次加人3．5一二 硝基水杨酸6 3g、NaOH 21g、苯酚5g、亚硫酸钠5g搅 拌使它们溶解，冷却后定容至1 000 m1．贮于棕色瓶． 两周后方可使用。
1 3标准曲线的制作
分别取木糖溶液O．1、0．2…0．7ml于试管中补加柠檬酸缓冲液至2m1．再加3 mlDNS混匀．煮沸10min，取出冷却后加水至25m1．以蒸馏水作空白．在540 nm处测OD值。可得到OD值与相应的木糖浓度的标准曲线．
1．4酶活力测定的一般方法
1 4．1粗酶液的制备 取出发酵后的酶液8000r/min离心5min．上清即为粗酶液。
1．4．2酶活力测定 取底物1mI于管中．据酶活大小加适量稀释的粗酶液(要求最终测酶活时OD值在0．2加8之间)，补加柠檬酸缓冲液至2m1．50℃水浴反应30。in．加3mlDNS混匀，煮沸lOmIM，取出冷却后加水至25m1．在540nm处测OD值。以每分钟产生lUmol分子木糖的酶量作为一个酶活单位。
l 5制定因素位级表
根据预备试验，选定pH值、反应温度和反应时间3个因素．每个因素取4个水平，本试验不考察各因素问的交互作朋。选用正交表L16(45)，见表1。
|
表1 因素水平 | |||
|
水平 |
A |
B |
C |
|
pH值 |
温度（℃） |
反应时间（min） | |
|
1 |
4 |
45 |
10 |
|
2 |
5 |
50 |
15 |
|
3 |
6 |
55 |
30 |
|
4 |
7 |
60 |
45 |
2结果和分析
2．1测定条什的正交试验结果
表2 正交实验结果
|
序号 |
A（PH值） |
B（温度℃） |
C(反应时间min) |
酶活（IU） |
|
1 |
1 |
1 |
1 |
1.88 |
|
2 |
1 |
2 |
2 |
1.42 |
|
3 |
1 |
3 |
3 |
0.38 |
|
4 |
1 |
4 |
4 |
0.25 |
|
5 |
2 |
1 |
3 |
2.25 |
|
6 |
2 |
2 |
4 |
2.08 |
|
7 |
2 |
3 |
1 |
4.43 |
|
8 |
2 |
4 |
2 |
4.06 |
|
9 |
3 |
1 |
4 |
1.76 |
|
10 |
3 |
2 |
3 |
2.67 |
|
11 |
3 |
3 |
2 |
3.71 |
|
12 |
3 |
4 |
1 |
5.13 |
|
13 |
4 |
1 |
2 |
3.08 |
|
14 |
4 |
2 |
1 |
3.03 |
|
15 |
4 |
3 |
4 |
2.03 |
|
16 |
4 |
4 |
3 |
2.77 |
|
K1 |
3.93 |
8.97 |
14.47 |
|
|
K2 |
12.28 |
9.2 |
12.27 |
|
|
K3 |
13.27 |
10.55 |
8.07 |
|
|
K4 |
10.91 |
12.21 |
6.12 |
|
|
k 1 |
0.98 |
2.24 |
3.62 |
|
|
k 2 |
3.21 |
2.3 |
3.07 |
|
|
k 3 |
3.32 |
2.64 |
2.02 |
|
|
k 4 |
2.73 |
3.05 |
1.53 |
|
|
R |
2.34 |
0.81 |
2.09 |
|
根据正交试验结果表2的极差R值可以得出，影响xYl905所产木聚糖酶活性的因素依次为A>C>B；即反应的nH值对酶活测定的影响最大，其次是反应时间．而反应温度的各个k值较为接近极差很小。冉从表3的方差分析结果来看，pH值和反应时间远远大于n。是极显著因素，而反应温度的F值小于F一，在实验选取的水平范围内不显著。
表3 方差分析
|
方差来源 |
方差 |
自由度 |
均方 |
F比 |
优化水平 |
|
A |
14.03 |
3 |
4.68 |
39** |
A3 |
|
B |
1.67 |
3 |
0.56 |
4.67 |
|
|
C |
10.93 |
3 |
3.64 |
0.33** |
C1 |
|
Se |
0.69 |
6 |
0.12 |
|
|
|
So |
27.32 |
|
|
|
|
注：Fom(3.6)=9.78，Fom(3.6)=4.76
2 2正交优化水平分析
从图l可以更直观的看出，pH在第2、第3水平时酶活较高，在第3水平时达到最大，若pH偏大或偏小酶活都明显下降；随着反应时间的延长，酶活性呈现明显的下降趋势，当反应时间为第1水平时所测的酶活最高：而反应温度呈缓慢上升趋势，从此趋势来看反应温度还需要进一步优化，此枯草芽孢杆菌木聚糖酶的最佳反应温度可能更高。比较表2中的k值，选出最优化水平组合为A3C1B4，即最适反应pH值为6．时间10min．温度60℃。但由于B因素不皿著，可以不取优化水平．即优化水平组合·可写为A3C1B。
2 3酶反应温度的进一步优化
将XYl905的木聚糖酶粗酶液分别在不同温度下测酶活．随着温度的升高酶活力逐渐下降，在60％：时酶活力最高．为该酶的最适作用温度(图2)。
2．4酶的热稳定性
将木聚糖酶粗酶液分别在不同温度下保温1h．然后按优化方法测定酶活力。以来保温的酶活力作为100％。结果表明，在40-60℃保温酶活力不仅没有下降反ifli有所升高，可能是在保温的较高温度下酶显得的更活泼，在加入底物之后能迅速发生反应．从而使所测酶活偏高；在70℃、80％保温酶活力下降4％左右。
2．5酶的pH稳定性
将粗酶液放在不同pH值的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液中，40℃保温2h按优化方法测定酶活力．在pH7时对酶活性影响最小．在酸性条件下．酶活随酸度的增加逐渐下降.
2 6金属离子对酶活性的影响
将粗酶液放在hnM／l的不同金属离子溶液中．40℃保温2h按优化方法测定酶活力。Ba2+对酶活有促进作川；Mn2+、K+、Zn2+对酶活有抑制作用．其中Mn2+的抑制作Hj最强，酶活下降14％：其它离子对酶活无明显影响．
3讨论
XYl905所产酶的最适测定条件为pH6．反应时间10min，反应温度60~C，可初步判定此酶在偏酸性环境及较高温环境下有较高酶活．有做饲料添加剂的潜力．另外，反应时间若是更短，酶活性会更高．但由于自动化程度不高，为了减小误差仍选反应时问为10min。
此酶的热稳定性在已发表的木聚糖酶中可能是最好的．在80~C下保温lh剩余酶活为96．44％：真菌生产的木聚糖酶耐热性普遍较差．保温1h半失活温度在55~C左右．现用的饲用酶制剂巾木聚糖酶…]在85℃湿热处理10rain剩余酶活为34．62％：由于此酶的热稳定性很好就可以保证在饲料加工的制粒过程中酶活性几乎没有损失．、
此酶对lmM／1的金属离子不太敏感．而青霉菌所产酶在1mg/的浓度下受Cu2+的强烈抑制．剩余酶活为27．3％．因此不同来源的木聚糖酶对金属离子的敏感程度有较大差异。
