新型酶制剂―β-甘露聚糖酶研究进展

博特美^TMβ-甘露聚糖酶（1）

新型酶制剂――β-甘露聚糖酶研究进展

植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β-1,4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基团，图1为甘露聚糖的分子结构示意图。甘露聚糖具有高亲水性，在单胃动物的消化道内大量吸水，增加了消化道内容物的粘度，抵抗胃肠的蠕动，直接影响动物对营养物质的消化和吸收。近年来，随着豆类产品（豆粕等）在动物饲料中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养作用也越来越受到重视，在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途径。甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）、β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、 β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)和脱乙酰酶(EC3.1.1.6)的协同作用，其中β-甘露聚糖酶在饲料中的应用比较广泛。

1.  β-甘露聚糖酶的来源和酶学性质研究

β-甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，在一些低等动物（如海洋软体动物Littorina brevicula）的肠道分泌液中、某些豆类植物（如长角豆、瓜儿豆等）发芽的种子中以及天南星科植物魔芋萌发的球茎中都发现了β-甘露聚糖酶酶活的存在。而微生物（包括真菌、细菌和放线菌等）则是饲用β-甘露聚糖酶的主要来源， 各种微生物产生β-甘露聚糖酶的条件和所产酶活性的高低、酶的性质和作用方式以及蛋白质一级结构等均有所不同。微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活性高、成本低、提取方便以及比动植物来源的有更广的作用pH 值、温度范围和底物专一性等显著特点，备受研究者的重视，其中，细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌，真菌中的曲霉、青霉、酵母、木霉和放线菌中的链霉菌等产的β-甘露聚糖酶等研究的较多，表1中列出了部分微生物产的β-甘露聚糖酶及其酶学特性。

目前，已有许多不同来源的β-甘露聚糖酶获得了纯化，如田新玉（1993）首先报道了嗜碱性芽孢杆菌Bacillus sp.N16- 5 产生的3 种胞外碱性β-甘露聚糖酶。杨文博（1995）、余红英（2003）、吴襟（2000）分别对地衣芽孢杆菌Bacillus lichienoformis NK- 27产生的碱性β-甘露聚糖酶、枯草芽孢杆菌SA-22产生的中性β-甘露聚糖酶、诺卡氏菌形放线菌Nocardioform actinomycetes NA3- 540C 产生碱性β-甘露聚糖酶的纯化及性质作了报道。在真菌方面，田亚平（1998）、王和平（2003）分别就黑曲霉WX- 96所产的β-甘露聚糖酶、里氏木酶RutC-30 所产的酸性β-甘露聚糖酶进行了酶纯化和性质研究。国外Ademark （1998） 和Yosida（1997）分别报道了黑曲霉、环状芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的纯化和性质。不同微生物所产的β-甘露聚糖酶的分子质量、最适反应pH、等电点、最适反应温度、酶动力学常数、底物专一性等都有一定的差异。β-甘露聚糖酶的分子质量小的只有22 kDa，大的可以达到162 kDa，相差十分悬殊，但大部分在30 kDa～55 kDa。

表1. 部分微生物产生的β-甘露聚糖酶及其性质

图1 枯草芽孢杆菌 

图2  假单胞菌

真菌来源的β-甘露聚糖酶的作用范围偏酸，一般在pH 4.0～5.5之间，最适反应温度一般在55℃～75℃。如1990年Johnson K G研究的里氏木霉的甘露聚糖酶，最适pH为5.5，最适反应温度为65 ℃；李江华等研究的黑曲霉的甘露聚糖酶，最适pH为5.5，最适反应温度为35℃。细菌和放线菌来源的甘露聚糖酶最适作用pH却常为中性或者偏碱性，最适反应温度为45℃～70℃。细菌中，研究最多的是芽孢杆菌，除嗜碱芽孢杆菌高至pH 9.0以上之外，最适反应pH多为5.5～7.0。马建华等研究的枯草芽孢杆菌最佳反应pH为6.4，最适反应温度为50℃。总之，真菌来源的β-甘露聚糖酶作用偏酸性，而细菌和放线菌产β-甘露聚糖酶作用的pH近中性或偏碱性，且稳定性较好。单胃动物饲料中使用的β-甘露聚糖酶要求是酸性的，国内外对来源于不同菌种的β-甘露聚糖酶的生产有所报道，但多集中在碱性和中性β-甘露聚糖酶方面，而关于酸性β-甘露聚糖酶的微生物发酵生产国内很少有报道，因此，对酸性β-甘露聚糖酶的研究及进行工业化推广将在饲料工业中具有较大的应用潜力。

利用分子生物学手段，可以开发生产酶活性高、适应性强的微生物菌种。β-甘露聚糖酶分子生物学的研究进展较快，到目前为止有Rhodothermus marinus（Politz等，2000）、Dictyoglomus thermophilum Rt46B1（Gibbs等，1999）、Aspergillus aculeatus（Christgau 等，1994）、Bacillus stearothermophilus（Ethier等，1998）、西红柿种子（Bewley 等，1997）等多种微生物和动植物的β-甘露聚糖酶基因先后被克隆和表达，这些为开发新的、能满足饲料工业需要的产酶菌提供了条件。

2.  β-甘露聚糖酶的作用方式及其水解产物

β-甘露聚糖酶是水解1，4-β-D-吡喃甘露糖为主链的内切水解酶，作用底物主要是半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖以及甘露聚糖。不同来源的β-甘露聚糖酶对不同来源的底物作用深度及其水解产物是不相同的。β-甘露聚糖酶水解底物的方式和深度主要与α-半乳糖残基和葡萄糖残基在主链中的位置、含量、酯酰化的程度有关。底物本身的物理状态也会影响酶对底物的作用，如结晶状态的甘露聚糖不易被降解。甘露聚糖经β-甘露聚糖酶作用后，通过HPLC或纸层析方法分析，主要产物是寡聚糖（一般2～10个残基），产物聚合度的大小与酶和底物的来源有关（McCleary，1988；田新玉等，1993；杨文博等，1995；Arison- Atac等，1993），但相对来说产生单糖（甘露糖）很少或根本不产生。寡聚糖是一种新型的功能性低聚糖；能明显地促进人体和动物肠道内有益菌——双歧杆菌的增殖，改善肠道内菌群结构是一种很好的双歧因子。

3.  β-甘露聚糖酶的分子生物学研究

关于酶的分子特征和催化机制方面的研究报道还很少。吴襟等利用化学修饰的方法对诺卡氏菌形放线菌产的甘露聚糖酶的结构与功能进行了初步研究，证明了酶蛋白的巯基、酪氨酸残基及色氨酸残基是维持酶活性必需的基团。进一步研究证实蛋白内部的二硫键是影响该酶热稳定性的重要因素。Cann等从Thermoanaerobacterium  polysaccharolyticum中克隆到一种高分子量（119.6kDa）甘露聚糖酶，缺失突变证明了该酶含有两个纤维素结合区和一个催化功能区。

4.  β-甘露聚糖酶的应用研究

4.1  β-甘露聚糖酶在饲料中的应用研究

豆类、谷类及其副产品中普遍存在着一种抗营养因子——β-D-甘露聚糖，因不能被单胃动物消化，降低了饲料的利用率。β-甘露聚糖酶具有能分解β-D-甘露聚糖，降低消化道内容物黏度；破坏细胞壁的结构，使营养物质能与消化酶充分接触；提高动物内源酶(如淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶等)的活性；改善肠道微生物菌群和提高肠黏膜的完整性等功能。加入β-甘露聚糖酶能分解β-甘露聚糖，使之转化为甘露低聚糖，从而降低β-甘露聚糖的抗营养作用，提高饲料的利用率，促进畜禽生长，减轻环境的污染。另外，β-甘露聚糖酶分解β-D-甘露聚糖生成的甘露低聚糖，能吸附病原菌、促进肠道有益菌群的增殖，提高动物的生产性能。长期使用可防止沙门氏菌、肉毒杆菌等致病菌的感染、在肠道的繁殖和定植，减少抗生素的添加量。

β-甘露聚糖酶能降解饲料中的甘露聚糖，不仅消除了甘露聚糖的抗营养作用，同时生成的甘露寡糖在动物生产中起着重要的作用。Dvorak的试验证实，甘露寡糖能提高仔猪日增重和饲料转化率，其原因可能是其提高了仔猪的免疫力，抑制了病原菌在胃肠道的增值。甘露寡糖具有一定的免疫原性，能够刺激机体免疫应答，而且与病毒、毒素结合，减缓抗原的吸收，能够调节肠道的菌群，干扰病原菌的定植。近年来关于甘露寡糖吸附霉菌毒素的研究也越来越受到人们的重视。Trenholm研究发现，甘露寡糖可结合玉米赤霉烯酮，通过物理吸附或直接结合霉菌毒素，且不影响其他饲料成分。

研究发现，甘露寡糖能够显著提高无菌仔猪血清和肠粘膜中IgA、IgG和IgM的含量及血液中白细胞

介素-2的水平，增强T淋巴细胞功能和小肠原始淋巴细胞的活性，增强小肠内白细胞的吞噬能力和促进淋巴细胞释放IFN-γ细胞素。邵良平等报道，甘露寡糖能极显著提高仔猪白细胞分化抗体CD₃的水平。

胃肠道非免疫防御系统主要组成成分为内源微生物群，而内源微生物群又常分为有益微生物群（如双歧杆菌属、真杆菌属、乳酸杆菌属）和有害微生物群（如大肠杆菌属。产气夹膜梭菌属、葡萄球菌属）。研究表明，甘露寡糖能调控动物胃肠道微生态环境，促进有益菌的生长和繁殖，抑制有害菌对肠道的粘附和定植。维持正常的消化道环境。 Sisak在日粮中添加0.1%的甘露寡糖，仔鸡盲肠、胴体沙门氏菌的检出率分别降低58%和56%。Spring 报道，甘露寡糖能加强猪对沙门氏菌、溶血性大肠杆菌和弯杆菌等感染的免疫应答。

目前，国内外规模化生产甘露聚糖酶的企业有美国的ChemGen、丹麦novozyme、北京博仕奥生物技术有限公司等。

β-甘露聚糖酶在单胃动物体内的作用位点决定了饲料中使用的β-甘露聚糖酶要求是酸性的（如表2）。

表2    β-甘露聚糖酶在动物体内的作用位点

Jackson等研究表明，β-甘露聚糖酶能提高玉米-豆粕型日粮鸡的饲料转化率，并促进肉鸡及火鸡的日增重和饲料利用率，提高蛋鸡的生产性能。在产蛋初期的前12周，在饲料中添加β-甘露聚糖酶，鸡蛋的平均重量可增加约0.3g／只；产蛋期的第12周到第24周，可使蛋鸡的日产蛋量提高 0.7％～1.07％；24周以后添加，日产蛋量可增加约1.5％。研究也表明，β-甘露聚糖酶能增加产蛋初期鸡蛋的重量，可延迟高峰后期的产蛋率的下降。肉鸡的研究数据显示，β-甘露聚糖酶可提高肉鸡的日增重和饲料利用率。王春林等报道，低添加β-甘露聚糖酶可以提高饲料的转化率。并且，日粮中添加β-甘露聚糖酶可通过内分泌和免疫调节途径提高鸡的抗病力，改善肉鸡的健康状况。李国胜等报道，试验组(基础日粮中添加0.05%β-甘露聚糖酶)体质量变系数为10%，对照组（基础日粮）体质量的变异系数为14%。

在饲料中添加β-甘露聚糖酶，可显著提高猪的采食量、饲料利用率、日增重；日粮粗纤维含量相同时，在饲料中添加β-甘露聚糖酶可减少猪粪的排泄量。Pettey等研究表明，在仔猪阶段，日粮添加β-甘露聚糖酶，能显著提高仔猪的采食量，促进饲料利用率，提高仔猪的生长速度和日增重，使猪的生长性能得到很大的提高。饲料中添加β-甘露聚糖酶能显著提高猪对于粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、无氮浸出物的消化能力，也可提高饲料的消化能。在猪的整个饲养阶段日粮添加β-甘露聚糖酶，日饲料消耗量、料肉比、饲养周期都得到明显的降低，平均日增重有了很大的提高。黄小文等报道，大猪日粮中分别添加1000U/g和2000U/g甘露聚糖酶比对照组平均日增重分别提高6.22%和12.99%。

4.2　在食品行业中的应用

β-甘露聚糖酶能够水解甘露聚糖，葡甘露聚糖，半乳糖甘露聚糖和半乳糖葡甘露聚糖生成甘露低聚糖。

甘露低聚糖作为双歧杆菌的增殖因子，可有效地使体内有益菌自然 增殖、改善肠道菌群结构、调节肠道消化系统功能，因此甘露低聚糖具有保肝、抗肿瘤、增强免疫力、加强肠道蠕动、降低胆固醇、抗衰老等生理活性，适用于各种肠道疾病，同时也适合于健康人特别是老年人和儿童的日常保健，再加上甘露低聚糖具有优良的甜味品质，可替代蔗糖，用于饮料、糖果、饼干、果脯和乳制品等食品中，是一种良好的食品添加剂，国外已广泛应用于保健品中。因此在食品中添加一定量的β-甘露聚糖酶，可降低营养物质在肠道内的蓄积，改善营养物质的消化吸收。

魔芋胶为葡萄甘露聚糖，经β-甘露聚糖酶作用后形成一系列的低聚糖。试验证明，魔芋胶的酶解物能有效地改善肠道内菌群结构，且其性能及效果优于大豆低聚糖及半乳糖基转移低聚糖。同时魔芋低聚糖对防治高血脂症、预防动脉硬化和冠心病的发生有一定作用。近年来发现，低聚糖对动物健康和生产机能的促进作用就某些方面来说，并不亚于抗生素，且为绿色食品，因而低聚糖不论作为功能性食品或是作为动物饲料添加剂均具有广阔的市场前景。我国是魔芋生产国，魔芋资源丰富，开发我国甘露低聚糖将有较大的社会效益和经济效益。

 图3   魔芋

图4  发酵设备