微卫星标记作为继RFLP之后的第二代分子标记，越来越受到研究者的青睐。本文就其特征、优点及在家畜遗传育种中的应用作一综述。 自20世纪70年代以来，人们就已经知道了真核生物基因组中微卫星的存在，然而直到1982年Hamada等人在酵母至脊椎动物中均发现poly（dT-dG）n核心序列的多拷贝之后，人们对微卫星数量之多、分布之广才有了深入了解。近年来，随着PCR技术及凝胶检测方法的不断发展与更新，微卫星标记越来越受到研究者的青睐，并发展成为继RFLP之后的第二代分子标记。 经典的家畜遗传育种研究中的形态性状标记因其自身固有的一些特点而在某种程度上已经不能满足现代遗传育种研究的需要，而分子标记的涌现则为家畜遗传育种研究带来了新的契机。近年来，微卫星标记以其独特的优点和特点而被广泛应用于家畜遗传育种研究的各个领域。本文就微卫星标记的特征、优点及其在家畜遗传育种中的应用作一介绍。 1．微卫星标记的特征及其产生机理 微卫星，又称简单序列重复（Simple sequence repeats，SSR），是指以少数几个核苷酸（1～10个，多数为2～4个）为单位多次串联重复的DNA序列。微卫星标记由核心序列和两侧保守的侧翼序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。 根据微卫星的结构，Weber 等将其分为三类，即完全的（Perfect）、不完全的（Imperfect）和复合的（Compound）微卫星。完全的微卫星是指由不中断的重复单位构成的微卫星；不完全的微卫星其重复序列中间有3个以下的非重复碱基，两侧不中断的部分重复数大于3；复合的微卫星则指两类或两类以上的串联重复单位由3个连续的非重复碱基分隔开，但不中断的重复单位的重复数不小于5。 关于微卫星的产生机制，普遍认为是DNA复制过程中滑动，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失。Valdas等认为从统计学角度看，微卫星的产生采用的是逐步突变模式（Stepwise mutation model，SSM），即每一次突变均增加一个或数个重复单位，从而导致一个新的等位基因的出现。微卫星的功能目前尚不甚明了，但已发现微卫星能参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程，有自身特异性结合蛋白，还能直接编码蛋白质，是一种非常活跃的碱基序列。 2．微卫星标记的优点 2.1 分布广泛 微卫星广泛分布于真核生物基因组中，不仅存在于内含子或非编码区，也存在于编码区及染色体上的其它任一区域，大约每隔10～50kb就存在一个微卫星。例如，猪基因组中存在着约65,000～100,000拷贝的二核苷酸重复单位AC/TG，平均每隔30～50kb就有一个。 2.2 高度多态，突变率低 在不同的个体中，微卫星重复单位数目的变异非常大，由此而造成了高度的长度多态性，并使其具有较高的信息。Dallas与Edwards等估计微卫星位点的突变率在10－4～5×10－6之间。因此，微卫星具有较高的多态性但其突变率却低于10－4，这在二者之间便有了一个很好的平衡。 2.3 等位基因与基因型检测方法简便 一个高度多态序列的等位基因小于500bp并且变动范围窄，则可以用PCR结合凝胶电泳法检测，因而微卫星序列就很好地符合了上述标准。微卫星PCR扩增所需样本量极少，并且由于微卫星序列较短，即使降解的DNA也可能包含足够用来扩增的微卫星序列。随着高效精确的基因分型自动化技术的发展，微卫星基因型检测将会更加快捷方便。 2.4 共显性标记 微卫星标记遵循孟德尔遗传法则，呈共显性遗传，因此能很好地区分纯合子与杂合子。 2.5 微卫星引物的通用性 微卫星侧翼序列的保守性以及物种间某些染色体区段的共线性，使得从一个物种获得的引物可以应用于相关的分类群。如de Gortari等从牛的1036个微卫星引物中筛选出605个可在绵羊基因组中扩增，同源率约为58%。随着一些物种已克隆微卫星数目的增加，今后可望无须在另一些物种中重新克隆微卫星，这样将会节省大量的人力物力。 2.6 中性标记 在多数情况下，微卫星标记没有任何表型效应，因而不存在对家畜个体的有害或次级效应。 3．微卫星标记在家畜遗传育种研究中的应用 3.1 遗传图谱构建 微卫星因其上述特点和优点而成为目前构建完整遗传连锁图谱时的首选标记。基本思路是，以微卫星为基础，在基因组中每隔一定距离找一个多态微卫星标记，当这些标记达到一定饱和度时（平均间隔不大于20cM并覆盖90%以上基因组），便可据此绘制出一个基本的遗传图谱。主要家畜如牛、绵羊、猪等的连锁图谱已建成，并且饱和度日趋增大。图谱上的标记以微卫星为主，也散在有少量的RFLP、RAPD及I型标记。 牛的第一张微卫星标记遗传连锁图谱由Barendse于1994年建成，至此已经又有几个不同版本的牛遗传连锁图谱绘制出。Kappes等发表的牛的第二代图谱上有1236个标记，图谱总长2990cM，常染色体上标记间平均距离为2.5cM。到目前为止，已公布了四张猪的遗传连锁图谱。在最近版的猪遗传连锁图谱上微卫星标记共计1042个，总长度2286.2cM，标记间平均距离为2.23cM。1992年Crawford等发表了第一张用微卫星标记构建的绵羊遗传连锁图谱，当时所使用的微卫星标记很少。1998年de Gortari等发表了绵羊的第二代遗传连锁图谱，其上共有标记519个，其中504个为微卫星，常染色体图谱总长度为3063cM，标记间距为6.4cM。这种高密度遗传连锁图谱的建成为基因定位、物理图谱的构建及基因的位置克隆（Positional cloning）奠定了基础。 3.2 数量性状位点（QTL）定位 QTL定位就是以一定饱和度的遗传连锁图谱为基础，通过连锁分析，确定家畜QTL在图谱上的位置、与特定标记间的遗传距离。QTL定位已成为目前家畜遗传育种研究领域的一个热点课题，其中基因组扫描（Genome scanning）是QTL定位的主要方法之一，即以已经构建的遗传连锁图谱为基础，利用连锁分析的原理分析基因组中大量散在分布的多态性标记（多数为微卫星标记）与数量性状变异的连锁关系，进而借助这些标记跟踪对数量性状表型有影响的功能基因在染色体上的位置及其效应，从而找到QTL。Andersson等率先在一个由欧洲野公猪与大白猪建立的资源家系中发现猪4号染色体微卫星S0001～S0107区域存在脂肪沉积和背膘厚的QTL。 3.3 标记辅助选择 借助微卫星进行标记辅助选择（Marker assisted selection，MAS）具有广阔的应用前景。MAS的一个应用是有利基因的转移。在传统的回交育种过程中，随着有利基因的引入，与有利基因连锁的不利基因（或染色体片段）也会随之导入，成为连锁累赘。然而利用与目的基因紧密连锁的微卫星标记，就可以直接选择在目的基因附近发生重组的个体，从而避免或显著减少连锁累赘，提高选择效率。MAS的另一应用是基因的累加。家畜有许多基因的表型是相同的，在这种情况下，经典的遗传育种研究就无法区别不同的基因，因而无法鉴定一个性状是受单个基因还是多个具有相同表型的基因共同控制。借助微卫星标记，先在不同亲本中将基因定位，然后通过杂交或回交将不同的基因转移至一个品种中，通过检测与不同基因连锁的微卫星标记的基因型来判断个体是否含有某个或几个基因，以帮助选择。 3.4 遗传多样性评估 家畜遗传多样性一般指品种内个体在DNA水平上的差异。通过对遗传多样性的评估，可了解家畜品种的遗传结构、生活背景，分析其进化的历史和潜力，以及探讨品种濒危的原因和现状，提出合理的保种措施。为此，利用微卫星标记，检测个体基因型，统计群体中的微卫星位点等位基因的数目和频率，结合分子遗传学和数量分类学原理，计算各个品种的遗传变异程度、生存稳定性，初步评估品种的遗传多样性及品种间的关系亲缘与分化关系。Kacirek等利用18个微卫星分析了大白、约克夏及汉普夏三个猪种间的遗传变异。杨澜利用5对牛微卫星引物和10对绵羊微卫星引物分析了5个中国地方山羊品种的遗传多样性。 3.5 系谱确证 在家畜育种中必须搞清楚畜群的亲子关系，这样才能利于根据亲属信息准确选留个体并能防止群体近交的发生。然而在某些情况下（如寄养、母畜返情重配等），却不能准确判断某一个体的亲代。如今借助多个微卫星标记位点在群体中的等位基因频率，通过计算排除率（Exclusion probability）便可进行亲子鉴定和血缘控制。Ellegren等研究表明，组合使用5个微卫星位点（每个位点有6个以上的等位基因）时排除率为98%，而使用10个这样的微卫星时排除率可高达99.99%[25]。Van Zereren等利用7对微卫星引物对4个比利时猪种进行亲缘关系鉴定，排除率均超过95%。可见使用这种方法对家畜进行系谱确证是非常适合的，因为基因型结构的基本元素对于亲代和子代是完全相同的。 此外，微卫星标记还可应用于疾病的基因诊断、性别控制、保护遗传学等方面。相信随着人们对微卫星标记认识的不断深入与完善，它必将成为家畜遗传育种研究领域的一种强有力的工具,发挥其独特的优势。
