牛海绵状脑病（BSE，又称疯牛病）是牛的一种致死性神经系统疾病，即众所周知的传染性海绵状脑病（TSE），最近科学家推测进食含BSE的牛肉与人群发生变异型克雅氏病（vCJD）有关［1～2］。这些疾病的特征是潜伏期长，可从数月至数年，潜伏期内无可见症状，牛BSE平均潜伏期为4～6年，在人是至少9年[2]，患者出现短暂神经症状后死亡，目前尚无有效治疗方法。目前在英、法、德、瑞士、丹麦、阿曼、葡萄牙、爱尔兰、比利时、卢森堡、西班牙、意大利等国均有报道。至2000年1 月份，英国共有384万多头牛被销毁。自从英国于1996年发生第1例vCJD病以来，到2000年1月，单英国就有52人患此病死亡。因此BSE对人畜健康和食品安全卫生的影响后果非常巨大，引起世人广泛关注。对于该病病原，普遍认为是由一种蛋白质性的感染颗粒也称为朊蛋白引起的，是一种病理细胞朊蛋白（PrPSc），由正常细胞朊蛋白（PrPc，约250个氨基酸的蛋白质）转变而来，不含DNA或RNA。病原对外界理化因素抵抗力极强，高压蒸汽灭菌134～138℃ 18 min不能使病牛脑组织完全灭活，对次氯酸钠溶液，NaOH溶液有很强抵抗力，常规组织固定方法不能灭活。BSE流行病学和传播途径研究表明，BSE的发生可追溯到被TSE如痒病病原污染的加工饲料成分、白粉及肉骨粉（MBM）等[1～2]， MBM是哺乳动物组织加工产品，是最普遍应用的动物饲料的蛋白质来源，MBM被认为是主要的传播途径，而今MBM在许多国家被禁用于反刍动物饲料，对动物饲料的控制、禁止使用反刍动物蛋白甚至所有哺乳动物组织成分词喂反刍动物，禁止牛源性风险成分进入动物及人食物链是防止BSE侵入和传播，保证人身安全免受VCJD侵害的关键措施。中国、欧盟各国、美国、日本等国都颁布了有关公告和禁令。能否很好地执行这些规定在很大程度上取决于检测食品及反刍动物饲料中的禁止成分。食品和饲料中动物性成分及种类鉴别分析方法主要取决于对DNA、蛋白及骨片段的分析。但是食品和饲料制备过程中的热处理可破坏及降解DNA及蛋白质，因此对这些分析方法有一定影响。
1 DNA分析方法
DNA分析方法是分离鉴定生物性材料的一种常用方法，DNA存在于细胞核中（基因组DNA）、线粒体（线粒体DNA）以及植物细胞叶绿体等细胞器中。热处理对DNA的结构有两种影响，其一是使DNA变性，双股DNA分子变成单股，某一DNA分子变性的温度各不相同，取决于GC含量、盐分、长度及 DNA拓朴结构等。线性DNA通常在60～100℃变性；其二是改变DNA的初级结构，高温高压下DNA分子变成短片段。DNA分析方法的目标序列通常是种间高度保守的序列，核糖体DNA是常用的种类鉴别序列，卫星DNA及随机重复序列也被应用到，其他数种染色体及线粒体DNA也被用于肉类鉴别，DNA分析方法常选用杂交及选择性扩增方法。
1．1 DNA杂交DNA杂交方法分指纹技术及完整DNA方法。前一种常用Southern印迹，在杂交前DNA被酶切成小片段，并按大小分开；另一种方法，如斑点杂交方法适用完整DNA分子。DNA指纹技术不适用于化制产品，因为DNA降解过程会产生不同大小的DNA片段，将会影响结果判定。斑点杂交技术适用于热处理产品，该方法被应用于80℃、100℃及120℃加热处理的鸡、猪、山羊、绵羊及牛肉的DNA分析，探针是使用每种动物的基因组 DNA。该方法检测限可达0．l mg。但是山羊、绵羊与牛存在很大交叉反应，因为他们的基因组很相似。交叉反应可用未标记的绵羊DNA进行阻断。为了鉴别热处理肉类，以卫星DNA为靶序列设计的22个碱基的探针用于鉴别牛、山羊、绵羊、马、鹿、猪、鸡和火鸡肉，经过120℃ 90 min高压处理，虽然强度减弱但杂交信号仍很清晰，检测限可达l％～5％，另外用PCR产生的可与种类特异性卫星DNA结合的探针杂交技术更耐用，可检测鲜肉0．l％～0.5％，高压处理肉样品0. 5 ％～5 ％ [2]。
1．2 PCR扩增 PCR技术是应用耐热DNA聚合酶特异性地扩增目的DNA片段，扩增的片段可以用以下方法进行分析和鉴别：凝胶电泳、DNA测序、单链同一性分析（SSCA）、质谱分析等。PCR方法使用几种不同的目的序列，线粒体DNA是一种很好的序列，因为每个细胞中含有大量线粒体基因组（约2 300个拷贝），方法的灵敏度大大提高，Tartaglia等［3～4]介绍一种检测反刍动物饲料中牛线粒体的PCR方案，该方法以牛线粒体DNA的 tRNA的3´端、ATPase 8和ATPase 6的氨基端为目的片段，此片段在植物中未发现，并且在脊椎动物中表现为高度变异性。该方法可以检测牛源性MBM 0．125％样品中的牛线粒体DNA，该方法经FDA多方评估，但没有确定灵敏度，也非定量。而且该方法是牛特异性的，不能检测其他反刍动物成分。另一种方法应用于盐腌、加热或发酵肉品的种类鉴别[5～6]，所用引物是脊椎动物线粒体Cytb基因的保守区互补系列。对目的DNA片段的限制性内切酶分析可检出多种野生动物及猪、牛、山羊、马、鸡、火鸡的限制性片段多态性，PCR－RFLP分析方法从含牛肉的热处理肉类混合物中检出低于l％的牛肉。22种未知 cytb基因序列的动物包括偶蹄动物和禽类的种内和种间差异可用20种不同限制性内切酶进行分析。有人研究了热处理肉中猪肉的PCR检测方法［7～8]，该方法扩增18S核糖体及线粒体基因高度保守区序列，可从鲜肉及热处理牛肉和猪肉混合物中检出低于2％的猪肉。
哺乳动物广谱性的间断性重复序列用于包括牛以及鸵鸟近30种动物DNA的指纹分析，该方法可产生20～60条带，比等电聚焦电泳分析（IEF）信息更丰富。经 120℃ 20 min处理的肉类及这些动物的DNA均用该序列的引物扩增，经DNA测序分析，虽然热处理引起DNA降解（至300 bp大小），但与同种动物的完整DNA鉴定结果是一致的。
2 蛋白质分析方法
热处理对蛋白结构的影响有4种情况：第一，使蛋白变性，改变蛋白二、三级结构，打开氢键及破坏其他较弱的二三级联系；第二，改变蛋白质的初级结构，在较高温度及压力下，氨基酸间共价键断裂，蛋白质降解至多肽；第三，氧化－SH键成S－S键；第四，蛋白质与碳水化合物反应形成复合体。任何一种旨在分析热处理蛋白的方法必须将这些因素考虑在内，这些方法主要是免疫学和电泳方法。
2．1 免疫学方法 很多免疫学方法用来鉴别粗加工肉类的动物种类，但是不能用于热处理肉品，常用的免疫学方法是ELISA及Western印迹及生物传感器技术。
2．1．1 肉类分析的ELISA方法 ELISA是一种基于可溶性抗原与抗体反应的简便方法，该方法不能检测变性凝聚的热处理蛋白。另外，还有一些成分如明胶可能与抗体交叉反应给出假阳性结果。英国及爱尔兰检测饲料中牛源蛋白的官定方法是应用硫酸铵沉淀可溶性蛋白除去明胶，浓缩蛋白，然后应用热稳定性多克隆抗体双夹心 ELISA方法。这种样品纯化／ELISA方法可以检测加热140℃1.5 h的动物饲料中的牛羊热稳定蛋白。但是硫酸铵沉淀使该方法相当繁琐，对方法的重复性没有进行研究，另外这种方法可以检测大多数牛蛋白，不能区分禁止与允许蛋白[9]。
其他还有一些检测蒸煮肉类蛋白ELISA方法，例如 Cortecs诊断公司 ELISA试剂盒鉴定经 133℃20 min热处理的猪、牛、禽肉中的羊肉。 138℃ 20min高温则无效，另外还有应用热稳定性抗原的特异性多克隆抗体检测煮肉、罐头肉中的禽肉。当样品处理120℃15min其检测限分别是：鸡和火鸡 126mg／kg，猪肉250mg／kg［10］。有些学者应用单克隆抗体检测煮禽肉中的任何哺乳动物肉类，一种单克隆抗体与经 100℃15 min加热的五种哺乳动物（肉牛、猪、绵羊、马、鹿）有强烈反应。但不与鸡、火鸡和鸭或0．5％的鲜肉反应［11］
2．1．2 生物传感器生物传感器依靠某些物质与表面固化的受体分子如抗体的反应来选择性检测溶液中的目标成分如毒素、某种特定蛋白等。生物传感器在食品中有所应用，还未适用于饲料。
2．2 电泳方法 广泛应用的是SDS－PAGE、毛细管电泳（CE）和等电聚焦（IEF）次之。
2．2.1 肉品的SDS－PAGE分析 应用SDS去污剂将蛋白变性及固定，带负电荷的SDS与肉品蛋白结合，蛋白所带净电荷与蛋白分子量大小成比例（蛋白自身所带电荷忽略不计），带负电荷蛋白被PAGE按大小分开，通过染色观察，每块胶可分析10～20个样品。经100℃ 20 min加热的猪肉可以经 SDS－PAGE分析，温度稍高（135℃ 20 min）蛋白变性，蛋白带强度减弱，低分子量蛋白背景加深，被降解程度取决于完整蛋白的分子量，一般而言，高分子量蛋白比低分子量蛋白降解程度大，肌球蛋白曾用于鉴别不同动物种类）[2]， SDS－PAGE曾用于求加工及加工样品的鱼种类鉴别，尿素及SDS用作提取，SDS比尿素提取法受样品状态（粗制品、60℃、85℃）的影响小。
Western免疫印迹是另一种免疫学方法，抗原成分先用SDS－PAGE分开，转移到膜上，然后与抗体反应，该方法曾用于罐头食品中细菌毒素分析，组织中是否存在牛源性CNS成分[12]及 PrPSc鉴定［13］。该方法与ELISA相比有几个优势，第一是蛋白经SDS－PAGE彼此分开并且与其他成分分开，所以不需硫酸按沉淀，可用于经 SDS固化的热处理蛋白的分析，另外易于干扰抗体结合的明胶也与其他蛋白分开，本方法检测限可达l ng／ml，免疫印迹法是一种重要的免疫学方法，可鉴定特异蛋白种类，使用特异性抗体可鉴别哺乳动物蛋白，并将禁止蛋白与允许蛋白分开。
2．2．2 毛细管电泳（CE）是在毛细管中以很高电压进行电泳，这样可以快速分离，提高清晰度及自动化程度。SDS聚合物充填的毛细管凝胶电泳（CE－SDS）用于鉴别肉蛋白的动物种类，肌质蛋白的CE－SDS图谱可用于动物种类的定量及定性特异性分析[2]，但尚未用于加热肉类的分析。
2．2．3 IEF IEF是另一种蛋白电泳方法，广泛用于鱼种鉴别，尿素等电聚焦电泳（UREA－IEF）用于鉴别粗加工及热处理的鱼类，受热处理影响很小，牛肌球蛋白的热稳定性曾用IEF进行分析［2]，可检测0．01mg／ml肌球蛋白，温度升高及时间延长，肌球蛋白凝胶强度减弱。
3 组织鉴定方法
3．1 骨组织鉴别 骨组织较普遍存在于动物性粉中。不象其他组织，骨组织可耐受热处理，是饲料分析的目标之一。饲料镜检广泛应用于反刍动物饲料中哺乳动物的检测，作为一种简单便利的方法收入AOAC官定方法［14］，通过观察，可以区分哺乳动物、禽类和鱼类。该方法需要相当有经验的检验员，骨片段的检测限在0．1％以下，可定量，但该方法本身不能区分动物的种类。
3．2 BSE及BSE相关组织分析上述一些方法是食品中动物成分检测分析的一般方法，除此而外，还有一些旨在检测BSE特征性的组织成分，主要是中枢神经组织（CNS），也有一些检测脱病毒相关蛋白PrPSc的方法。
3．2．1 牛CNS组织分析 BSE通过神经组织扩散，对食品中CNS组织存在的分析显得特别重要。已有肉产品中CNS检测方法的报道[12]，神经元特异性的烯酸化酶抗原对匀浆及高压热处理稳定。应用抗烯醇化酶抗原的单克隆及多克隆抗体的Western印迹方法，可以从香肠中检出猪肉中含1％～4％的牛脑成分。去除样品中脂肪组织灵敏度进一步增强，应用单克隆抗体可检测0．25％的脑组织。更特异性的牛CNS分析方法是检测胶质纤维酸性蛋白，作为肉牛血及肌肉组织中CNS组织的标志物，在骨骼肌、血凝块及坐骨神经中检出少量或不能检出，相反在CNS各部分均能大量检出。
3．2．2 检测朊蛋白 BSE诊断主要依赖于组织学分析，另一种方法是应用ELISA检测PrPSc。PrPc分子的抗蛋白酶核心位点的抗体应用于检测正常及BSE动物的脑组织中PrPc的含量，对天然组织，两组差异很小，但当加热及异硫氰酸胍处理后，ELISA可将牛脑匀浆物中BSE特异性的 PrPSc与PrPc区分开来，无明显临床症状的BSE感染动物可被检出，经对朊蛋白Western印迹法检测牛及羊朊病毒蛋白的灵敏度、特异性及可靠性进行分析，证明该方法是有效的。
4 小结
本文介绍了当前食品和饲料中动物性成分和动物种类鉴别的3种途径，即DNA、蛋白质和相关组织分析法，其中DNA分析方法具有明显优势。但到目前为止，以检测饲料中牛源性成分的方法居多，动物种类鉴别方法以PCR－RFLP分析给出比较丰富的信息。能否设计出反刍动物特异性的PCR方法，特别是反刍动物甚至哺乳动物特征性的快速定量方法乃是今后此类研究之趋势。
