牛血发酵菌株发酵条件的正交设计优化研究

  摘  要：利用平板划线法，从农村个体屠宰场土壤中分离获得菌株A2，通过单因素及正交试验，对影响菌株发酵能力的接种量、反应时间、反应温度进行优化。正交试验结果表明菌株A2发酵牛血的最佳条件是接种量为3%、发酵温度为41℃、发酵时间为30h。
    关键词：牛血；菌株；氨基酸态氮；可溶性蛋白质

    畜类血液是一种富含营养的蛋白质资源，具有很高的利用价值。我国是农业大国，畜血资源非常丰富，但除猪血得到少量利用外，其他动物血鲜见利用。利用现代生物技术将畜禽屠宰场废弃血液发酵制成价格低廉、营养丰富的高蛋白饲料或从中提取生物肽，不仅可以实现养殖场废弃资源的利用，而且可以大大缓解环境污染问题。目前对猪血的研究较多，而对牛血的研究很少有报道。本文通过单因素试验及正交设计试验，对牛血发酵条件进行优化研究，为进一步研究其作用机制及生产应用提供理论依据。

    1 材料和方法
    1.1 材料
    从多年从事屠宰的屠宰场周围土壤中分离获得菌株A2（参照文献筛选实验室保存）；牛血（预加抗凝剂，静脉无菌采取，冷冻保存）；可溶性淀粉，硝酸钾，三水磷酸氢二钾，氯化纳，琼脂牛肉膏，蛋白胨，酵母膏等均为国产试剂。
    主要仪器：722型可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司），PYX-250S-B型生化培养箱（广东韶关科力实验有限公司），HZQ-C型恒温振荡器（上海安亭科学仪器厂）。
    1.2 分析方法 
    将活化后的菌株A2一接种环量液体扩大培养后3%接种到牛血中，200 r/min，30℃，摇瓶培养后，测氨基酸态氮的含量和可溶性蛋白质含量（稀释15 000倍，以纯牛血为对照，下同）。氨基酸态氮含量测定采用电位滴定法，可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250法。
    1.3 试验设计
    经初步试验选定提取接种量、发酵温度、发酵时间作为主要影响因素 ，以发酵后牛血中氨基酸态氮含量和可溶性蛋白质含量为指标 ，在单因素试验的基础上采用三因素三水平正交设计试验，对菌株A2发酵牛血条件进行优化研究。
    1.3.1 接种量对菌株A2发酵牛血的影响 
    在150mL锥形瓶1～5中装入10mL牛血培养基，分别接一环已经活化的A2菌株，30℃培养48h，分别按1%、2%、3%、4%、5%接种到培养基上，30℃培养48h，取出培养液分别测定氨基酸态氮含量，并取少量8 000 r/min离心，取上清液测定可溶性蛋白质的含量。
    1.3.2 温度对菌株A2发酵牛血的影响
    除将发酵培养温度分别设置为29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃外，同1.3.1。
    1.3.3 培养时间对菌株A2发酵牛血的影响
    除将发酵培养时间分别设置为24、30、36、42、48、54h外，同1.3.1。
    1.3.4 正交设计优化
    取上述单因素试验中菌株A2发酵牛血后可溶性蛋白质及氨基酸态氮含量上升较多时的接种量、发酵温度、发酵时间3因素，设计3水平的正交试验。

    2 结果与分析
    2.1 接种量对菌株A2发酵牛血的影响

图1  接种量对菌株A2发酵牛血的影响

    从图1可以看出，接种量对A2发酵牛血能力的影响比较显著。接种量在3%时，A2发酵牛血能力最高（由于稀释倍数较高，测得数值较低，因此作图时放大了1 000倍，下同）。
    2.2 培养时间对菌株A2发酵牛血的影响

图2 培养时间对菌株A2发酵牛血的影响

    从图2可以看出，从24～30h，A2发酵牛血能力逐渐增强，到30h左右达到最高，然后开始下降，而且下降幅度较大。说明培养时间30h时，A2发酵牛血能力最高。
    2.3 培养温度对菌株A2发酵牛血的影响

图3  培养温度对菌株A2发酵牛血的影响

    从图3可以看出，培养温度在29～39℃时，A2发酵牛血能力变化不大，从39℃开始A2发酵牛血能力随温度上升逐步增强，在41℃时达到最大。说明培养温度在41℃时，A2发酵牛血能力最高。
    2.4 培养时间、温度、接种量正交试验

表1  L9（3³）正交试验及氨基酸态氮含量分析

    以牛血发酵后氨基酸态氮含量为指标通过正交设计试验表1的结果可以得出极差（R）：C> B>A，说明接种量对菌株A2发酵牛血的影响较大，其次为反应温度、反应时间。方差分析结果表明，C接种量、B温度的Sig均大于0.01小于0.05，说明接种量、培养温度对菌株A2发酵牛血的能力有显著影响，但未达到极显著水平，A培养时间对菌株A2发酵牛血的能力影响不显著，因此可以确定条件组合为C2B2A2。

表2  L9（3³）正交试验及可溶性蛋白质含量分析

    以牛血发酵后可溶性蛋白含量为指标通过正交设计试验表2的结果可以得出极差（R）：B> C>A，说明培养温度对菌株A2发酵牛血的影响较大，其次为接种量、培养时间。方差分析结果表明，C接种量、B温度的Sig均大于0.01小于0.05，说明接种量、培养温度对菌株A2发酵牛血的能力有显著影响，但未达到极显著水平，A培养时间对菌株A2发酵牛血的能力影响不显著，因此可以确定条件组合为B2C2A2。

    3 讨论与结论
    目前，大多数研究主要以灭菌干燥血粉为原料通过测定菌株蛋白酶活性来评价菌株性能并优化其发酵条件。利用菌株发酵动物血液的主要原因是把动物不好直接吸收的大分子蛋白分解为更加容易吸收利用的可溶性小分子蛋白或小肽，因此我们以可溶性蛋白质及氨基酸态氮含量为指标，通过单因素及正交试验，对影响菌株发酵牛血能力的接种量、发酵温度、发酵时间发酵条件进行优化，方差分析结果显著性，从而确定菌株发酵牛血的最适条件，具有更加直观经济的优点；另外以纯牛血替代传统的血粉更能体现真实性且能更好地保持血液的营养成分。
本试验最终结果可以确定菌株A2发酵牛血的最优条件组合为：接种量为3%，培养温度为41℃，培养时间为30h。
    （参考文献略）

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