超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中的己烯雌酚

摘  要：本文建立了饲料中己烯雌酚的高效液相色谱—串联质谱检测方法（UPLC-MS/MS）。色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱 2.1mm×50mm 1.7μm；流动相为乙腈—水（50：50，v/v），流速0.2mL/min；进样体积10μL；柱温35℃。采用负电喷雾离子源，在多反应监测（MRM）模式下进行分析，外标法定量，3对定性离子对分别为：m/z 320.90>151.85、320.90>256.92和320.90>193.90，定量离子对为320.90>151.85。在0.1～500μg/L浓度范围内呈良好的线性，相关系数r＞0.999。在1、5、20mg/kg 3个添加水平，平均回收率75.2%～97.6%，日内变异系数在2.1%～6.3%之间，日间变异系数在3.2%～9.7%，检测限为10μg/kg。
    关键词：饲料；己烯雌酚；高效液相色谱—串联质谱

    己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES） 化学名为1，2-双（4-羟苯基）-1，2-二乙基乙烯，俗名乙底酚，是一种人工合成的二苯乙烯类雌性激素，由于其具有促进动物生长、增加蛋白质沉积和提高饲料转化率的作用，曾经作为促生长剂广泛应用于畜牧养殖业。人长期食用残留有己烯雌酚的产品体内激素平衡将被扰乱，导致妇女的更年期紊乱、女童性早熟、男性女性化、生育能力降低，并诱发女性乳腺癌、卵巢癌等疾病。因此，世界上绝大多数国家禁止在食品动物中使用DES，2002年我国农业部规定DES禁止在饲料中使用，2003年农业部规定DES在可食性动物组织中不得检出。本文采用外标法定量，建立了饲料中己烯雌酚的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，该方法适用于配合饲料和预混料中己烯雌酚的检测。

    1 材料与方法
    1.1 仪器与试剂
    1.1.1 仪器
    超高效液相色谱—串联质谱联用仪（UPLC Quattro Premier），美国Waters 公司。
    1.1.2 色谱条件
    色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱 2.1mm×50mm 1.7μm；流动相为乙腈—水（50：50，v/v），流速0.2mL/min；进样体积10μL；柱温35℃。
    1.1.3 质谱条件
    离子源ESI（电喷雾离子源），扫描方式负离子扫描，检测方式MRM（多反应监测），离子源温度110℃，雾化气温度350℃，毛细管电压3.5kV，锥孔电压25v。
    1.1.4 试剂
    己烯雌酚标准品，含量99.0%，批号60518，购自德国Dr. Ehrenstorfer。甲醇为色谱纯。水为超纯水，用美国MILLIPORE超纯水仪自制。
    1.2 实验方法
    1.2.1 标准溶液贮备液（1mg/mL）的配制
    准确称取0.025g己烯雌酚标准品，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分摇匀，配制成1mg/mL的标准贮备液，密封，-20℃保存。
    1.2.2 标准工作溶液（50μg/mL）的配制
    用移液器取5mL贮备液（1mg/mL）于100mL容量瓶中，用甲醇定容，得到50μg/mL的标准工作液，密封，4℃保存备用。
    1.2.3 标准曲线的绘制
    分别准确吸取一定量的标准工作溶液（50μg/mL），用流动相稀释成0.1、1、10、50、100、500ng/mL的标准溶液，分别进样10μL，得峰面积。以己烯雌酚特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，采用外标法定量。
    1.2.4 样品前处理
    称取2.0g饲料样品置于50mL聚丙烯离心管中，加入2mL蒸馏水，待饲料浸润后再加入18mL甲醇，涡旋混匀1min，震荡10min，6 000r/min离心5min，取上清液，加入20mL正己烷，涡旋，震荡10min，6 000r/min离心5min，取下层液体，过0.20μm滤膜过滤后供高效液相色谱—串联质谱法测定，上机前用50%甲醇溶液10倍稀释。
    1.2.5 添加回收率和精密度的测定
    称取空白饲料2.0g置于50mL聚丙烯离心管中，设0.1、5、20mg/kg 3个添加水平，每个浓度做5个平行，按1.2.4方法处理，取10μL进样分析，每个浓度重复进样3次。根据峰面积计算添加回收率和日内变异系数，连续做3d，计算日间变异系数。
    1.2.6 灵敏度的测定
    取空白饲料做10个平行，按照1.2.4方法处理，测得基线噪音值，并求其平均值。按照信噪比S/N=3确定为检测限（LOD），S/N=10（LOQ）确定为定量限。

    2 结果与讨论
    2.1 方法的线性范围
    己烯雌酚浓度在0.1～500μg/L范围内，线性关系良好，线性方程为y=537.21x-104.47，相关系数r=0.9995（图1）。

图1 己烯雌酚标准溶液的工作曲线

    2.2 回收率和精密度的确定
    添加回收率和变异系数见表1。结果表明，在相应的保留时间内空白饲料对被测药物无任何干扰，本方法适用于饲料中己烯雌酚残留的检测。

表1 饲料中己烯雌酚添加回收结果

    2.3 灵敏度
    传统的液质联用流速较大、半峰宽较宽，导致色谱峰扩散、液质联用灵敏度降低，液相成为质谱灵敏度提高的瓶颈。近年来出现了基于小颗粒技术的超高效液相色谱（UPLC）技术，与传统的液相相比具有更高的分离能力、更快的分析速度，其流速小、半峰宽较窄、色谱峰扩散小，从而使液质联用灵敏度得到了极大地提高。该方法测定己烯雌酚在饲料中的检测限为10μg/kg，定量限20μg/kg。
    2.4 己烯雌酚的质谱条件优化
    己烯雌酚由于其化学结构中羟基、酰氨键的存在，具有很强的极性，在负离子模式下有较高的响应。故在负离子模式下进行全扫描，以乙腈-水（50:50，V/V）为流动相，采用流动注射泵连续进样，对己烯雌酚的质谱条件进行优化，以选择准分子离子峰（[M-H]-）和电离方式。根据己烯雌酚的响应和保留时间差异，设置了1个通道进行监测。结合基质空白和基质标准液的离子扫描图，优化参数，从而相应地确定了在多反应监测模式下信号采集的特征离子对，优化后的离子质谱参数见表2。

表2 己烯雌酚质谱参数

图2  己烯雌酚标准品（0.1μg/L）特征离子质量色谱图 （A）、空白饲料己烯雌酚特征
离子质量色谱图（B）、饲料中添加己烯雌酚（0.1mg/kg）特征离子质量色谱图（C）

    2.5 饲料样品前处理条件优化
    关于己烯雌酚饲料样品前处理的方法的报道，主要采用乙酸乙酯、甲醇和乙腈等作为提取溶剂，提取后过C18柱净化，该类方法费时，而且回收率也很低。而且采用乙酸乙酯作为提取溶剂，本底较高。2007年颁布的国标饲料中高效液相色谱-串联质谱检测方法前处理使用了液液分配净化和固相萃取柱净化，方法繁琐、回收率低、重复性差。本文采用甲醇提取，正己烷脱脂，有效去除了杂质干扰，前处理简单、快速、经济。己烯雌酚标准品、空白饲料、空白添加样品的特征离子质量色谱图见图2，由其可知，样品的杂质峰较少，己烯雌酚峰形良好。

    3 结论
    该方法分析饲料中的己烯雌酚，前处理方法操作简便、快速、净化效果好，可同时定性和定量，方法的回收率、重复性、检测限均能满足饲料中己烯雌酚残留检测的要求。
    （参考文献略）

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