配合饲料中饲用酶的加工稳定及检测

　　引言 目前世界上许多国家，常向单胃动物的饲料中添加酶。这显然是由于酶对单胃动物的生产性能有确定的改善作用，但要证实在商品饲料中有酶存在并非易事，对此，至今已进行了许多研究。酶是蛋白质，它与所有其他的饲料蛋白质一样，对饲料加工处理非常敏感。但饲料蛋白质是以氨基酸为单位而发挥作用的，所以无需维持构型，而饲料酶在饲料加工过程中要么发生不可逆的变性，要么不再发挥作用。因此，有必要检测配合饲料中酶的活性。本文的重点不是讨论现有的酶活的测定方法，而是阐述饲料中所用酶的特性，包括不同来源酶对体外热稳定性之间的差异、因酶与饲料基质的互作而给分析带来的难题（及消除这种效应的方法）、饲料加工试验的有关数据以及未来的发展趋势。

　　大多数猪禽配合饲料均需要进行一定程度的加工处理。有些饲料需要制成颗粒，其加工过程是先通过蒸汽，对饲料混合物进行调质，然后经压摸挤压成颗粒。制粒可以提高饲料的营养浓度，改善饲料的储藏特性，并减少饲料中的微生物含量。制粒温度一般为65~90摄氏度（Gibson，1995），这样高的温度可以破坏对热敏感的营养素（包括酶）。

　　在过去几年中，人们对饲料源病原体以及影响制粒质量的因素的关心，促使饲料生产商提高饲料加工的温度、时间和压力，并将饲料进行二次制粒或膨化（Pickford，1992）。饲料加工处理程度的加强使酶的稳定性更加重要。目前已采取几种途径来克服这难题，包括通过在饲料颗粒冷却后添加液态酶以避免一起加工处理对酶活性的影响。尽管可以在制粒后加酶，但饲料酶一般还是在加工处理前添加到粉状饲料中。通过使用疏水性包被保护层或选用耐热性更强的酶，可以降低热处理的对酶活的影响。

　　至今公开发表的有关饲料酶活性保存率的研究资料仍然有限（Chesson，1993）。然而，酶的稳定性对于饲料生产商来说极其重要，必须保证在酶制剂销售之前进行酶的实验室评定。1993年以来，在报刊或会议论文集上已有多项研究成果报道。在评论性的科技文献中也有几项试验结果。显然，活体外测定酶活，无论是在溶液中还是在饲料中，都是极其重要的。最近的研究表明，体外酶活的测定值必须通过体内效应的检测结果来验证。

　　植酸酶

　　由于植酸酶使用量约占商品酶制剂用量的20%，所以有关植酸酶热稳定性的研究报道相当多（Bedford和Schulze，1998）。之所以如此受到关注，可能是由于许多植物性的饲料原料中均含有植酸，由于植酸的存在使得磷和其他营养素难以吸收利用（Cheryan，1980；Eeckhout和dePaepe，1994；Ravindran等，1995）。然而，单胃动物体内的内源性植酸酶缺乏活性或活性很低（Pallauf和Rimbach，1997）。更为复杂的是，同一植酸来源的植物还含有相当数量的植酸酶，并且磷消化的营养性问题与因磷在土壤中的富积而引起的环境污染问题相互交织。磷污染已成为集约化畜禽产区生产的限制因素。

　　植酸酶的来源广泛，其特性也各不相同。Liu等（1998）综述了1998年之前的文献。结果表明，来自细菌、真菌、酵母和植物的植酸酶的最适活性温度为45~77摄氏度，其差异高达32摄氏度。Dvorakova等（1997）描述了从黑曲霉（Aspergillus niger）中分离到的植酸酶特性。该植酸酶在25~65摄氏度的温度范围内具有活性，其最适温度为55摄氏度；其在60摄氏度下培养10分钟可使最初活性丧失5%，而在80摄氏度下培养10分钟可使最初活性丧失80%。作为寻找耐热性酶类的部分工作，Wyss等（1998）对从烟曲霉（A. fumigatus）和黑曲霉（A. nige）中分离到的纯化植酸酶的热变性进行了研究。这两种来源的植酸酶在低至55摄氏度时就会发生变性。然而，在温度提高到90摄氏度时，来自烟曲霉（A. fumigatus）的植酸酶再次折叠成一种活性构型，但来自黑曲霉（A. nige）的植酸酶不会发生这种变化。无疑，某些耐热性的植酸酶类在不久的将来将投入商业使用。

　　溶液中的酶遇热失活，并不表明饲料中的酶遇热也失活，这是因为饲料中的酶与饲料基质存在互作。实际上，饲料原料在短时间内能够保护酶免受蒸汽或高温的破坏（Chesson，1993）。测定颗粒饲料中的植酸酶活性为商业上评价饲料中植酸酶失活的程度提供了更准确的数据。Simons等（1990）将植酸酶添加到“通用猪饲料”中，该饲料在制粒前被加热至50摄氏度或65摄氏度。结果表明，加热至50摄氏度时使颗粒温度达到78摄氏度或81摄氏度，此时并未使酶的活性降低；但加热至65摄氏度时使颗粒温度达到84摄氏度或87摄氏度，此时则使酶的活性丧失17%或54%。Gibson（1995）在小麦基础日粮中添加3种植酸酶制剂，并在65~95摄氏度温度下制成颗粒饲料。结果表明，其中2种植酸酶制剂在65摄氏度制粒温度下就已失活了，仅剩下1种植酸酶制剂在85摄氏度以上制粒温度下还保留相当数量的活性。除了研究酶在溶液中的稳定性之外，Wyss等（1998）还在制粒（75摄氏度或85摄氏度）前将从烟曲霉和黑曲霉中分离到的植酸酶添加到商品饲料中。结果表明，在制粒温度为75摄氏度时，这两种植酸酶在颗粒饲料中的活性回收率是相似的；但在制粒温度为85摄氏度时，来自黑曲霉的植酸酶活性比来自烟曲霉的植酸酶活性要丧失得更多，这也支持了他们有关变性动力学的研究结果。Eeckhout 等（1995）将商品植酸酶制剂添加到饲料中，结果表明，制粒温度为69~74摄氏度时可使植酸酶活性丧失50%~65%。

　　失活不仅影响添加到饲料中的微生物酶类的作用，而且也影响到饲料原料中天然存在的酶类的作用。Gibson（1995）发现，在85摄氏度以上温度下制粒将使小麦中的内源调查性植酸酶活性大量失活。Eeckhout和dePaepe（1994）在对不同饲料中植酸酶活性的调查报告中报道，小麦麸富含植酸酶，但其制粒样品的植酸酶活性仅为未制粒样品的56%。Jongbloed和Kemme（1990）通过3个试验发现，在接近80摄氏度下制粒可使猪饲料中的植酸酶活性降低，其中猪饲料是以富含或缺乏植酸酶活性的饲料原料为基础配制的。他们还进一步进行了试验，以测定制粒对磷的表观吸收率的影响。他们在其中两个试验发现，对富含植酸酶的饲料制粒使磷的吸收率降低，该结果与内源性植酸酶失活的结果一致。

　　研究机构与饲料工业对有关植酸酶稳定性研究的关注，是由于目前所用的加工温度越来越高，以及因营养与环境因素使得磷的吸收率越来越重要。对外源性酶类增加包膜或制成颗粒，为目前保护酶类免受热破坏提供了一种方法。更为基本的方法可能就是耐热性酶类的分离或者在酶变性后再次还原到活性构型。另人遗憾的是，这些方法都不能防止高温对饲料原料中含有的内源性酶类的破坏。

　　β-葡聚糖酶

　　由于β-葡聚糖酶制剂的商品化生产，使得大麦可作为饲料原料添加到家禽日粮中，并且不会因高β-葡聚糖水平而降低家禽的生产性能及产生粘性粪便（Campbell和Bedford，1992）。目前，β-葡聚糖酶已广泛用于世界大麦产区。不过，有关热处理对添加到饲料中β-葡聚糖酶影响的研究报道仍然有限。

　　Eeckhout 等（1995）对在50~95摄氏度下调质和在72~91摄氏度下制粒的商品仔猪料中的β-葡聚糖酶活性进行了测定。结果表明，即使在最低温度下，饲料中的β-葡聚糖酶活性在加工后亦丧失40%，而在最高温度下，仅保存7%的活性，并且2/3的活性是在调质期间丧失的。另一方面，Esteve-Garcia等（1997）发现，添加到肉仔鸡料中的β-葡聚糖酶经过接近80摄氏度的调质与制粒温度仍能保留大部分的活性。其所使用的酶被制成微细颗粒。这表明，β-葡聚糖酶可以稳定的形态添加到饲料中。

　　至少有2个试验对肉用雏鸡在饲喂经热处理的酶补充日粮后的生产性能进行了测定。McCracken等（1993）在大麦基础日粮中添加了一种稳定形态的商品酶混合物，其中含有β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性，日粮在制粒前于85摄氏度温度下加热15分钟。结果表明，日粮在未补充外源性酶的情况下进行热处理，使饲料营养物质的表观消化率降低、肉用雏鸡肠道内容物的粘度增加及粪便干物质含量减少；但在补充外源性酶的情况下进行热处理，则提高了饲料营养物质的消化率，并消除了热处理引起的不利效应。这充分说明，酶在85摄氏度温度下仍保持活性。Vukic-Vranjes等（1994）测定了两种日粮中添加商品酶混合物的效应，其中一种日粮含有20%的大麦。该酶混合物含有β-葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶和果胶酶活性。这两种日粮在70~75摄氏度下调质，在110~120摄氏度下制粒或挤压膨化。与制粒相比，挤压膨化对雏鸡生产性能产生不利影响。同时，挤压膨化还使饲料的体外粘度增加，这表明高温使饲料中非淀粉类多糖的溶解度增加。对日粮不论是制粒还是挤压膨化，补充酶混合物都改善了雏鸡的生产性能，这表明日粮经过挤压膨化的加工处理后仍然存在酶活。Vukic-Vranjes等（1994）的研究还表明，在日粮中补充酶混合物降低了饲料浸提物的粘度，这说明饲料在雏鸡采食前存在酶活。他们甚至在处理饲料之前仍不能排除饲料中酶活的存在。

　　Inborr和Bedford（1994）对补充酶并经热处理的饲料中的酶活及饲喂该饲料的肉鸡生产性能进行了测定。结果发现，在大麦基础日粮中添加的β-葡聚糖酶（该酶与1993年McCracken等所使用的酶是同一产品）在日粮经75摄氏度下调质及制粒后发生明显失活。在95摄氏度下调质30秒和15分钟分别使β-葡聚糖酶活性丧失84%和91%。Inborr和Bedford（1994）试图确定体内外酶活的测定是否是评价加工处理对酶活影响的最准确的方法。结果表明，酶活的回收率在最低加工温度下最高，而在最高加工温下最低，但该结果并不能通过肉鸡的生产性能准确得到体现。肉鸡体增重的最高值和耗料增重比的最低值是在居中的调温度（85摄氏度）下获得的。显然，酶在该温度下仍然保持活性，并且热处理的正效应超过酶失活的负效应。

　　Pickford（1992）研究表明，β-葡聚糖酶的稳定化处理可使其免受75摄氏度制粒温的影响，但不能承受95摄氏度的制粒温度。Cowan和Rasmussen（1993）报道，商品β-葡聚糖酶在65摄氏度以上制粒温度下明显失活，但若对该产品进行涂抹处理，则可使其免受75摄氏度制粒温的影响。以上两个报道都很简短，有关提高β-葡聚糖酶热稳定性的研究报道非常有限。

　　木聚糖酶

　　木聚糖酶在世界酶销售量中占有最大的份额（Bedford和Schulze，1998），它的应用使得高粘度的小麦可作为饲料原料添加到家禽日粮中，并且不会产生不利的效应。或许由于其经济上的重要性，科技文献中有关木聚糖酶稳定性的报道要比有关β-葡聚糖酶稳定性的报道多得多。

　　木聚糖酶可由多种真菌和细菌生产，其酶活的最适条件各不相同，这并不令人惊奇，因为每种生物体内都有特定的适应环境。Bedford和Schulze（1998）的综述表明，许多真菌和细菌生产的木聚糖酶的最适温度为30~105摄氏度，最适pH值为2.0~10。Pickford（1992）在未提供酶所含酶活类型资料的情况下比较了3种商品酶制剂的稳定性。结果表明，在80摄氏度的制粒温度下，第一种酶制剂的活性保留85%，第二种酶制剂的活性保留55%，第三种酶制剂的活性仅保留33%。而在95摄氏度的制粒温度下，这3种酶制剂的活性都全部丧失。在短时高温下挤压膨化也使这3种酶制剂的活性发生较大的损失，其酶活损失的差异与上述相似。

　　Pettersson和Rasmussen（1997）研究证实，由高温霉（Thermomyces）、腐质霉（Humicola）和木霉（Trichoderma）分离到的木聚糖酶在热稳定性上存在差异。由木霉（Trichoderma）分离到的木聚糖酶在75摄氏度调质温度下明显失活；而由高温霉与腐质霉分离到的木聚糖酶在85摄氏度调质温度下可保留80%以上的活性。其中由高温霉分离到的木聚糖酶，即使在95摄氏度的调质温度下仍可保留70%以上的活性。Gibson（1995）观察了9种木聚糖酶制剂之间的变异，其中7种在试验开始时为商品酶制剂产品。结果表明，经90摄氏度加工处理后，其中一种酶制剂保留90%以上的酶活，另外7种保留的酶活均低于10%。该报道还不足以说明其变异有多少是由于酶的来源，有多少是由于酶的稳定化处理。Perez-Vendrell等（1999a）测定了8种商品酶制剂（包括涂抹或包被产品）在65~70摄氏度、75~80摄氏度和85~90摄氏度调质处理后的体外稳定性。结果表明，即使在最低的调质温度下，大多数产品的酶活仍然至少丧失30%；而在最高调质温度下，其酶活可丧失90%。Esteve-Garcia等（1997）报道，正如对β-葡聚糖酶研究所发现的那样，细微颗粒型木聚糖酶制剂的酶活在接近80摄氏度的调质与制粒温度下也不失活。

　　在前面已提及几种免受热处理破坏的保护方法。最基本的酶活保护方法就是Pettersson和Rasmussen（1997）在其研究中所建议的方法，即从耐热性的微生物体内中分离生产耐热性的酶类。另一种酶活保护方法就是在制粒冷却后在其饲料颗粒上喷涂酶制剂，但这需要额外增加某些加工设备及加工工序（Perez-Vendrell等，1999b）。

　　对干燥酶制剂产品也可进行稳定化处理，从而提高其热稳定性，并可在制粒前将其添加到饲料中而不使其酶活发生明显的损失。稳定化的方法就是前面所提到的方法。酶的失活是由于调质所用的蒸汽造成的。因此，对酶制剂进行稳定化处理主要是通过将酶制剂吸附到一种载体上或在酶制剂上涂抹疏水性基质，而使酶制剂免受蒸汽的破坏（Cowan，1996）。Pickford（1992）提供了一个例证，其稳定化处理使酶制剂经75摄氏度制粒后保留的酶活从48%提高到76%，使经95摄氏度制粒后保留的酶活从12%提高到34%。显然，即使进行稳定化保护的酶也有热稳定的极限。Steen（1999）建议，如果饲料要在90摄氏度以上的温度下加工，即使进行稳定化处理的酶类也应在加工后添加到饲料中。

　　体外酶活检测是确定酶活损失的有价值的手段。检测结果表明，即使经受相对较低的温度，也会导致酶活发生明显的损失。不过，体外检测仅仅是其中的一种手段。显然，在饲料的处理与消化条件下，缓冲液中的酶制剂在最适pH值下的活性仅仅提供非常有限的酶活信息。事实上，大多数研究人员（Vukic-Vranjes等，1994；Pettersson和Rasmussen，1997；Perez-Vendrell等，1999a；等等）已经认识到酶与饲料之间互作的重要性，并且测定了配合饲料中的酶活。饲料浸提液粘度的测定（Spring等，1996；Bedford等，1997）为在饲料被家禽采食前评定酶活的效应提供了一种指标。Preston等（1999）研究证实了这种效应的存在。其结果表明，即使在其饲料终产品中完全丧失酶活，补充酶制剂仍可使家禽生产性能明显改善。

　　为了弄清饲料加工处理对酶作用的影响，必须通过家禽生产性能来测定饲料中酶的添加效应与热处理效应。酶的失活并不总是通过家禽生产性能的差异直接得到反映（Bedford等，1997；Perez-Vendrell等，1999a；Silversides和Bedford，1999）。Bedford等（1997）发现，随着加工温度从65摄氏度增加到105摄氏度，酶的失活百分率呈线性变化，而肉鸡的生产性能（体增重、耗料增重比）是在81~83摄氏度的加工温度时达到最佳。Silversides和Bedford（1999）也证实了热处理的这种效应，如图15-1所示。随着加工温度的增加，酶的活性呈线性方式降低（R2=0.97），肉鸡的体重则呈二次方曲线变化（R2=0.84）。对耗料增重比的结果作图亦产生相似的结果（R2=0.98）。最大的体重和最低的耗料增重比是在80~85摄氏度之间的加工温度下获得的。之所以产生这样的结果，有两种可能性：一种可能是酶几乎在调质器中完成它的作用，从而使制粒后的分析值毫无关联；另一种可能是所用的分析方法不能有效地测定酶活。

　　由涂抹保护层的高温霉获得的酶类数据与由未涂抹保护层的木霉或曲霉所获得的酶类数据似乎不属同一类型，这可能是由于前者不存在酶与饲料基质之间的互作。在这种情况下，酶更易被提取，其回收的酶活与家禽生产性能之间的相关性也得到证实（Cowan和Rasmussen，1993；Pettersson和Rasmussen，1997；Andersen和Dalboge，1999）。这些相互矛盾的结果表明，在酶的特性未知的情况下，并没有唯一的方法可以根据饲料样品的分析值来确定家禽的生产性能。

　　随体外酶活的下降而提高家禽的生产性能，预示着仅仅依赖酶活测定的危险性，但也许并不像显示的那样矛盾。加热除了影响酶外，还影响其他许多方面（Pickford，1992）。适度加热可以促进淀粉的凝胶化，加速细胞壁的破碎，提高营养素的利用率，从而改善家禽的生产性能。这也是对饲料进行制粒处理的基本原因之一。较高的加工温度也会使非淀粉类多糖的溶解度增加，从而增加了家禽肠道内容物的粘度，降低了家禽的生产性能，这实际上又增加了对外源性酶的需要。Silversides和Bedford（1999）研究表明，在小麦基础日粮中未添加外源性木聚糖酶的情况下，肉鸡肠道内容物的粘度随加工温度的增加而显着增加（图15-2）。而在日粮中添加木聚糖酶时，即使在较高的加工温度下，也可使肉鸡肠道内容物的粘度下降，并且在最高温度下，其粘度实际降低量最大。在较高的加工温度下，酶仍可发挥较大的作用，这可能是由于酶在此时可获得较多的底物。酶在加工前或加工期间可能具有活性，从而降低了体内外的粘度测值。较高的加工温度使家禽的生产性能下降，这不仅是由于肠道内容物粘度的增加以及外源性酶的作用减弱，而且是由于维生素和其他酶类的失活，以及淀粉与蛋白质消化率的下降。随着耐热性或稳定化处理的酶制剂的商品化，加热对维生素及其他营养物质的破坏也将可能限制生产上所用的加工温度。

　　结论与趋势

　　酶在溶液中的活性在低于60摄氏度的温度下可能就会降低。酶在混合饲料中多少要受到饲料原料的保护，大多数在稍低的温度下可能是很稳定的。然而，在高达95摄氏度的加工温度下，酶活将发生严重的损失。为了降低热处理的不利效应，已采用或推荐使用几种方法，包括保护酶免受蒸汽渗入、使用耐热性酶类或者在加工后添加液态酶。饲料酶在动物采食饲料前可能具有一些活性，因此体外酶活的总损失可能并不总是意味着收益的总损失。这似乎部分依赖于酶及其分析方法。在一些情况下，体外的分析值就是一种误导；而在另一些情况下，酶的含量与动物的生产性能具有明显的相关关系。由于维生素、蛋白质及淀粉对热处理可能比外源性饲料酶更加敏感，提高加工温度就会增加对这些营养物质的破坏，所以一般加工温度不能无限制地提高。进一步开发耐热性的酶类及在饲料加工或被动物采食前发挥酶的作用，可能是饲料工业通过添加酶类而获得最大收益的有前景的途径。