猪肉中氟苯尼考残留量高效液相色谱-串联质谱检测方法的建立

摘  要：本研究通过高效液相色谱-串联质谱法(High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS)建立了猪肉中氟苯尼考残留物残留量的检测方法，检测限和定量限分别为5 μg/kg和10 μg/kg。在10 μg/kg～4 000 μg/kg浓度范围内，空白猪肉样品的标准曲线线性关系良好，相关系数均在0.99以上。氟苯尼考和氟苯尼考胺的添加浓度在10 μg/kg、500 μg/kg和2 000 μg/kg时，回收率均大于85％，批间和批内变异系数均小于5％。该方法适用于猪可食性组织中氟苯尼考残留量的测定。关键词：氟苯尼考；残留量；猪；检测氟苯尼考是一种动物专用的半合成酰胺醇类抗生素，有众多的优点，抗菌谱广，动物体内分布广泛，注射或内服均吸收良好，既无潜在致再生障碍性贫血作用，也无致畸、致癌或致突变作用。氟苯尼考能有效治疗由巴氏杆菌和睡眠嗜组织菌引起的牛呼吸道系统疾病，可用于防控猪胸膜肺炎放线杆菌、链球菌和巴氏杆菌引起的猪呼吸道疾病，也可有效治疗鱼类的细菌感染，因此在畜禽养殖中的使用日益频繁。随着氟苯尼考的广泛使用，动物源性食品中氟苯尼考残留问题也引起消费者的担忧，加强氟苯尼考残留监控需建立特异性高、灵敏度好的检测方法。目前，针对氟苯尼考残留量检测方法包括微生物法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法(High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS)和气相色谱法。其中微生物法的灵敏度和特异性较差，且操作烦琐；酶联免疫吸附法操作简单，但灵敏度较差；高效液相色谱法准确性高，特异性好，但灵敏度同样较差；HPLC-MS/MS准确性高，灵敏度高，特异性好，虽然对仪器设备要求较高，但是极高的灵敏度更适合监控食品中的氟苯尼考残留[1-3]。本研究通过分析比较氟苯尼考检测方法，优化前处理以及色谱条件，建立了一种准确性高、灵敏度高、重复性好的检测猪可食性组织中氟苯尼考残留量的液相色谱-串联质谱法。1  试验材料1.1 药品与试剂氟苯尼考和氟苯尼考胺对照品：含量均为99.5％，购自中国兽医药品监察所。乙腈、甲醇和甲酸为色谱纯，乙酸乙酯、正己烷、氨水、乙酸铵为分析纯。1.2 仪器设备 液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(HPLC-MS/MS)[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号Thermo Scientific TSQ Endura]。1.3 标准储备液氟苯尼考储备液：准确称取10 mg氟苯尼考于50 mL容量瓶，乙腈定溶，配制成200 μg/mL氟苯尼考标准储备液。氟苯尼考胺储备液：准确称取10 mg氟苯尼考胺于50 mL容量瓶，甲醇定溶，配制成200 μg/mL氟苯尼考标准储备液。1.4 混合标准工作液分别量取适量200 μg/mL氟苯尼考和氟苯尼考胺的混合标准储备液，用乙腈稀释，制成5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL和4 000 ng/mL的混合标准溶液，现配现用。1.5 其他溶液配制3％氨水-乙酸乙酯溶液：准确量取    30 mL氨水，加入970 mL乙酸乙酯混匀即可。2  方法2.1 制备试样取均质后的空白猪肉样品，作为空白试料；取均质后的空白猪肉样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。2.2 样品处理准确称取搅碎后的猪肉样品5.00 g (±0.05 g)，装入50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL 3％氨水-乙酸乙酯液，涡旋混匀5 min，在10 ℃下10 000 r/min离心10 min，将上清液转移到另一50 mL聚丙烯离心管中。下层残渣再用20 mL的3％氨水-乙酸乙酯液提取一次，合并以上两次上清液，备用。移取以上备用液5 mL，50 ℃氮气吹干。残渣用2 mL流动相复溶，加入5 mL正己烷漩涡混匀30 s，然后以5 000 r/min离心10 min，收集下层水相，再用5 mL正己烷重复净化一次，最后用0.22 µm的无机滤膜过滤水相，滤液用(HPLC-MS/MS)检测。2.3 基质标准曲线的绘制吸取适量系列混合标准工作液，加入“2.2 样品处理”所述残渣复溶后的空白溶液，制备空白基质溶液，使其进样终浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、4 000 ng/mL，进行液相色谱-串联质谱测定，以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，以对应的基质标准溶液浓度为横坐标，绘制基质标准曲线，计算标准曲线回归方程以及相关系数。2.4 仪器条件色谱柱：安捷伦科技有限公司的Agilent Zebox C18 色谱柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，流动相A为0.1％氨水，流动相B为乙腈，流速300 μL/min，进样量25 μL，柱温40 ℃。液相洗脱梯度：0 min～1 min维持85％ A；1 min～2 min线性变化至15％ A；2 min～3 min维持15％ A；3 min～4 min线性变化至85％ A；4 min～5 min 维持85％ A。电离源：电喷雾离子源，采用正/负离子混合模式；扫描方式为选择反应监测(SRM)模式；传输毛细管温度350 ℃；干燥气温度300 ℃；鞘气压力310.26 kpa；辅助气流速12 L/min；Ion Sweep气体压力13.79 kPa；电子倍增器电压3 700(+)/3 500(-) v；碰撞气为高纯氩气(纯度为99.99％)；离子源选择电喷雾离子源(ESI)。氟苯尼考胺选择248.1/229.9(定量离子)，碰撞能量10，248.1/130.1(定性离子)，碰撞能量20；氟苯尼考选择，－355.9/－335.9(定量离子)，碰撞能量13，－355.9/－184.9(定性离子)，碰撞能量19。2.5 检测限(LOD)和定量限(LOQ)的确定5个空白猪肉平行样品，按照“2.2 样品处理”所述方法前处理后上仪器检测，测得基线噪音，将信噪比≥3时的浓度定为检测限，信噪比≥10时的浓度为定量限。2.6 准确性准确性用添加样品回收率表示，于 50 mL聚丙烯的离心管中称取3份5.00 g(±0.05 g)均质好的空白猪肉样品，每份样品分别加入1 000 ng/mL、50 000 ng/mL、200 000 ng/mL的混合标准工作液0.1 mL，使混合标准工作液在各样品中的浓度分别为20 ng/g、40 ng/g和1 000 ng/g。通过“2.2 样品处理”所述方法前处理后，上机检测的各样品最终上机浓度为10 ng/g、500 ng/g、2 000 ng/g，进样体积为25 μL，HPLC-MS/MS测定定量离子峰面积，同时用HPLC-MS/MS测定对应浓度的混合标准工作液(10 ng/g、500 ng/g、2 000 ng/mL)的定量离子峰面积。各个浓度分别重复5次，回收率的计算公式如下： 式中：A为预处理后组织中氟苯尼考、氟苯尼考胺的实测定量离子峰面积；AS为对应浓度的混合标准液中氟苯尼考、氟苯尼考胺的定量离子峰面积。2.7 精密度精密度以空白猪肉添加样品测定的日间变异系数和日内变异系数表示。称取3份    5.00 g(±0.05 g)均质的空白猪肉样品，装入50 mL聚丙烯离心管，分别加入1 000 ng/mL、50 000 ng/mL、200 000 ng/mL混合标准工作液0.1 mL，使混标在各组织中的浓度分别为20 ng/g、1 000 ng/g和4 000 ng/g。按“2.2 样品处理”所述的方法处理，上机检测的各组织最终浓度为10 ng/g、500 ng/g、  2 000 ng/g，取25 μL滤液进行HPLC-MS/MS测定，同时用25 μL对应浓度的混合标准工作液(10 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL)，进行HPLC-MS/MS测定。各浓度样品同一天内重复测定5次，HPLC-MS/MS测得氟苯尼考、氟苯尼考胺定量离子峰面积，用标准曲线回归方程计算各样品药物浓度，求出日内变异系数。一周内5 d分别检测三个浓度样品，每个样品重复测定5次，HPLC-MS/MS测得氟苯尼考、氟苯尼考胺定量离子峰面积，用标准曲线回归方程计算各样品药物浓度，求出日间变异系数。3  结果3.1 基质标准曲线、检测限(LOD)和定量限(LOQ)在以上质谱条件下，氟苯尼考和氟苯尼考胺标准工作液(药物浓度在10 μg/kg～4 000 μg/kg范围内)各个浓度与其峰面积成良好的线性关系(R2≥0.99)，方法的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为5 μg/kg和10 μg/kg。氟苯尼考回归方程为Y＝9 816.3x＋301 250，R2＝0.998；氟苯尼考胺回归方程为Y＝67 312x－403 487，R2＝0.999。3.2 添加回收率与精密度对10 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL三个样品添加浓度进行回收率测定，添加回收率与精密度结果见表1和表2。4  讨论4.1 氟苯尼考残留量检测氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的提取方法有许多，提取试剂通常为乙酸乙酯、乙腈、甲醇和丙酮等。比较不同的提取试剂对回收率的影响，甲醇和乙腈提取率较差，回收率较低；氟苯尼考胺为弱碱性物质，用乙酸乙酯提取时加入适量氨水。提取效果更佳，回收率也更高。相对于用丙酮或二氯甲烷提取，用乙酸乙酯加氨水混合后提取，带入的干扰物质较少，可以进一步简化净化过程，无须固相萃取小柱的净化，极大节约了样品前处理的成本，故本试验选择乙酸乙酯氨水混合溶液为提取试剂。用强阳离子交换固相萃取柱进行净化时，氟苯尼考、氟苯尼考胺的回收率为70％～75％，在进行对比试验时，不过柱处理，将备用液直接氮吹，之后用水复溶，经过两次正己烷净化处理后，氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率均能达到85％以上，并且净化液在通过0.22 μm的滤膜时无阻力，滤液清澈，说明此方法符合要求。本研究流动相A为0.1％氨水，流动相B为乙腈，弱极性的氟苯尼考保留性较强，而极性较强的氟苯尼考胺保留性较弱，保留时间不到2 min，因此选择低流速0.3 mL/min以延长氟苯尼考胺的保留时间。氟苯尼考质谱条件较为成熟，负模式电喷雾离子源定性离子为 －184.9，定量离子为－335.9。氟苯尼考胺为碱性样品，在正模式电喷雾离子源扫描下，130.1为定性离子，229.9为定量离子。在此条件下其丰度值大，受杂质干扰小。本试验中，在氟苯尼考胺保留时间之前，通过切换阀将流动相中强干扰物质切换到废液中，可以减少对目标物的干扰。4.2 方法学评价本研究建立的氟苯尼考残留量检测方法，其检测限和定量限分别为5 μg/kg和10 μg/kg。在10 μg/kg～4 000 μg/kg范围内，氟苯尼考和氟苯尼考胺在各组织的空白添加标准曲线线性关系良好，相关系数均在0.99以上。各组织空白样品添加浓度在10 μg/kg、500 μg/kg和2 000 μg/kg时，回收率均大于85％，批间和批内变异系数均小于3％。该方法适用于猪可食性组织中氟苯尼考残留量的测定。

参考文献[1] 谢恺舟，张小杰，陈学森，等. 氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺在鸡肌肉中的残留消除规律[J]. 畜牧兽医学报，2012，43(8)：1298-1305.[2] 孙雷，张骊，王树槐，等. 超高效液相色谱-串联质谱法检测动物源食品中氯霉素类药物及其代谢物残留[J]. 中国兽药杂志，2009，43(3)：42–45.[3] 郭霞，张素霞，李建成，等. 虾肌肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的高效液相色谱检测方法研究[J]. 中国兽药杂志，2008，42(7)：13-16.