饲料中“瘦肉精”的检测方法及注意事项

一． “瘦肉精”的危害
    “瘦肉精”是肾上腺类神经兴奋剂，属β－兴奋剂类激素，是指能够促进瘦肉生长的药物添加剂。目前，常见的被称为“瘦肉精”的药物添加剂主要有莱克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇、特布他林、西布特罗、西马特罗、齐帕特罗、氯丙那林、马布特罗、溴布特罗、班布特罗等11种，其代表物主要是克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇。另外，近期在饲料中检测出的“瘦肉精”新品种苯乙醇胺A，再次敲响食品安全的警钟。
  “瘦肉精”添加到饲料中，不但可以提高动物饲料转化率、生长速度，还可以使动物的肥肉减少，瘦肉增加，胴体瘦肉率可提高10%以上。但作为饲料添加剂，使用剂量是人用药剂量的10倍以上，才能达到提高瘦肉率的效果。其用量大、使用的时间长、代谢慢，所以直至屠宰前到上市，“瘦肉精”在猪体内的残留量都很大。残留的药物通过食物进入人体，就会使人体蓄积中毒，因此目前被禁用。
但一些饲料加工企业及养猪饲养业主为谋取暴利，仍在饲料中添加 “瘦肉精”，前后只需10～20d的时间，就可把一头普通猪催变成瘦肉型猪。使用“瘦肉精”的生猪皮毛光亮，宰后肌肉特别鲜红，后臀肌肉饱满，肥肉特别薄。屠宰后的猪肉由于“瘦肉精”的蓄积，色泽鲜红诱人十分抢手。
    “瘦肉精”进入动物体内会在组织中形成残留，尤其是在肝脏等内脏器官残留较高。食用含有“瘦肉精”的肉和内脏组织会对身体产生危害，常见的有恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状，特别对心脏病、高血压、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，长期食用则可能导致染色体基变，诱发恶性肿瘤，严重的可导致死亡。
     2 饲料中“瘦肉精”的检测
    实验室中主要检测的是克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇三种。检测方法有胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法（ELISA）以及仪器法。现就以上几种检测方法浅谈试验过程中的几点注意事项。
    一、胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法为竞争抑制法，适用于饲料中“瘦肉精”的快速筛选检测，克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇这三种的检测卡较为常见。检测卡含有被事先固定于硝酸纤维膜测试区（T）的抗原和控制区（C）的Ⅱ抗以及固定于结合垫上的金标抗体。样品经简单前处理，取上清液滴入检测卡的样品孔中，根据两条色带的颜色判断阴性和阳性。

使用检测卡筛选，一般注意以下几点：

1.样品处理所需容器要保证干净无污染。

2.检测卡的事宜温度在15-25℃，在过高或过低温度下不适于检测。

3.于样品孔中应滴加无气泡的液体3-4滴。

4.试验中一定要做阴性对照，要用阴性样品做对照，不能用水或其他液体代替。

5.在规定时间内观察C线及T线，一般只要C线显色，T线无论颜色深浅均可判定为阴性。

二、 酶联免疫吸附法（ELISA）
  

 1.原理

ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

2.试样的准备：为保证样品充分被提取，可适当延长涡旋时间、离心时间及离心转数，效果比较理想。

3. 试剂的准备

3.1不同批次的试剂盒不能混用，特异性不同。

3.2 ELISA中用的蒸馏水或去离子水，应为新鲜的和高质量的。

3.3试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

3.4检测过程中应保持在室温20-25℃，避免阳光直射下实验。

 4. 加样
 4.1加样时应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡，当有气泡时，可用干净的枪头小心刺破。
4.2在加酶标物、底物、终止液时，建议尽量使用多道移液枪，以缩短反应时间。动作一定要迅速、准确，避免枪头碰壁或液体溅出。

5. 保温孵育

5.1一般为常温（20℃-25℃）温育，可根据室温适当调节保温时间。

5.2孵育期间，如工作台温度过低，应适当铺垫若干纸巾或其他材料。

5.3孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性。

 6. 洗板

6.1将孔内液体甩干时，动作要快，要把整板垂直倒置，将液体甩出，防止各孔液体混流，最后在吸水纸上拍干，不可甩干。此种方法可有效避免试剂盒孔的交叉污染。

6.3洗板次数和两次洗板间隔时间应尽量按照说明书进行。
7. 显色
7.1在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。

7.2在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。7.3定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。
8.测定
8.1对定量判定应绘制半对数曲线，从曲线上读出样品对应浓度值。

8.2对于每次试验浓度值的准确性判定可观察标准样品的吸光度值是否为线性关系，即吸光度值是否呈梯度递减来判定。当吸光度值无明显梯度时应考虑重新检测。

8.3当板间差异性大时，可能原因是板与板之间孵育时间相差太大，板与板之间洗涤不一致，移液枪使用不当，温度不同等。

  三、仪器法

1、高效液相色谱法：
    2.2.1 方法原理
    用加有甲醇的稀酸溶液将饲料中的盐酸克仑特罗盐酸盐溶出，溶液碱化，经液液萃取和固相萃取净化后，直接在HPLC仪上分离、测定，或经衍生后于GC—MS仪器上分离、检测。
    2.2.2 样品处理
    称取样品适量（配合饲料5g，预混料和浓缩料2g）精确至0.0001g，置于100mL三角瓶中，准确加入提取液（偏磷酸 : 甲醇=80 : 20，其中偏磷酸的浓度为0.5%）50mL，振摇使全部润湿，放在超声水浴中超声提取15min，期间每5min振摇一次，取上层液于离心机上4 000rpm离心10min。准确吸取上清液10.00mL，置150mL分液漏斗中滴加2mol/L氢氧化钠溶液，充分振摇，将pH调至11～12，溶液用30、25mL乙醚萃取两次，令醚层通过无水硫酸钠干燥，用少许乙醚淋洗分液漏斗和无水硫酸钠，并用乙醚定容至50mL。准确吸取25.00mL于50mL烧杯中，置通风橱内、低于50℃加热块或沙浴上蒸干，残渣溶于2.00mL 0.02mol/L盐酸溶液，取1.00mL置于预先已分别用1mL甲醇和1mL去离子水处理过的SPE小柱上，用注射器稍试加压，使其过柱速度不超过1mL/min，再先后分别用1mL SPE淋洗液—1（含2%氨水的5%甲醇水溶液）和—2（含2%氨水的30%甲醇水溶液）淋洗，最后用甲醇洗脱，洗脱液置70±5℃加热块或沙浴上，用氮气吹干。
    2.2.3 HPLC法（筛选法）
    在净化、吹干的样品残渣中准确加入1.00～2.00mL 0.02mol/L盐酸溶液，充分振摇、超声，使残渣溶解，必要时过0.45μm的滤膜，清液上机测定，用盐酸克仑特罗标准系列进行单点或多点校准。
    2.2.4 GC—MS法（仲裁法）
    在净化、吹干的样品残渣中加入衍生剂BSTFA 50μL，充分涡旋混合后，置70±5℃烘箱中，衍生反应30min。用氮气吹干，加甲苯100μL，混匀，上机测定。同时用盐酸克仑特罗标准系列做同步衍生。

    3 “瘦肉精”的危害
    20世纪80年代初，美国一家公司为增加瘦肉率开始将“瘦肉精”添加到饲料中，此举不但可以提高动物饲料转化率、生长速度，还可以使动物的肥肉减少，瘦肉增加，胴体瘦肉率可提高10%以上。但作为饲料添加剂，使用剂量是人用药剂量的10倍以上，才能达到提高瘦肉率的效果。其用量大、使用的时间长、代谢慢，所以直至屠宰前到上市，“瘦肉精”在猪体内的残留量都很大。残留的药物通过食物进入人体，就会使人体蓄积中毒，因此目前被禁用。
    早在2002年，我国农业部、卫生部、国家食品药品监督管理局就发布公告，明令禁止在饲料和动物饮用水中添加盐酸克仑特罗和莱克多巴胺等7种“瘦肉精”。2008年，最高人民检察院、公安部规定新的刑事案件立案追诉标准，对使用 “瘦肉精”养殖生猪，以及宰杀、销售此类猪肉的，将以生产、销售有毒、有害食品罪追究刑事责任。但一些饲料加工企业及养猪饲养业主为谋取暴利，仍在饲料中添加 “瘦肉精”，前后只需10～20d的时间，就可把一头普通猪催变成瘦肉型猪。使用“瘦肉精”的生猪皮毛光亮，宰后肌肉特别鲜红，后臀肌肉饱满，肥肉特别薄。屠宰后的猪肉由于“瘦肉精”的蓄积，色泽鲜红诱人十分抢手。
    “瘦肉精”进入动物体内会在组织中形成残留，尤其是在肝脏等内脏器官残留较高。食用含有“瘦肉精”的肉和内脏组织会对身体产生危害，常见的有恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状，特别对心脏病、高血压、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，长期食用则可能导致染色体基变，诱发恶性肿瘤，严重的可导致死亡。

    4 “瘦肉精”的添加成因及利益驱动
    20世纪90年代初“瘦肉精”流入中国后，饲料生产商通过添加“瘦肉精”来提高产品的市场占有率和影响力，当时，大多数人还不知道此类添加剂的危害。但后来发现人吃了这种猪肉后，易出现心跳加速、呼吸困难等症状。香港、广东等地发生的因食用猪肺汤中毒事件，才使“瘦肉精”问题浮出水面。
    盐酸克伦特罗自21世纪初被国家明令禁止添加之后，很快被成本约为1 400元/kg的盐酸莱克多巴胺替代，与前者相比，盐酸莱克多巴胺长期被漏检，此外，还有沙丁安醇等，这些“瘦肉精”安全性相对较高，被称为“瘦肉精二代”。
    “瘦肉精”在某种程度上对养殖户形成了一种利益驱动，这是“瘦肉精”黑市交易长期盛行的关键所在。

    5 “瘦肉精”的监管与预防 
    从近几年风险监测的结果看，非法使用的主要是盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇3种“瘦肉精”药物，各地的监督抽查工作也就相应地集中在这3种药物上。美国、加拿大、墨西哥等20多个国家先后批准将莱克多巴胺用于猪、牛、羊等动物养殖，除莱克多巴胺外，其他“瘦肉精”类药物都没有被批准用于生猪养殖。近年来，美国一直向欧盟和我国施压，要求解除莱克多巴胺使用禁令，但欧盟和我国基于安全性考虑不同意解除该禁令。“瘦肉精”难以禁绝关键在于利益驱动。解决“瘦肉精”问题的根本出路，还是要大力推进生猪标准化规模养殖，完善活畜流通追溯体系，加快转变畜牧业发展方式。
    “瘦肉精”是国家明令禁止在牲畜饲料和饲养过程中使用的药品，制售和使用“瘦肉精”等违禁药品的违法行为不仅危害人民群众身体健康，还危害养殖业的持续健康发展和社会安定。因此，要突出源头治理，从源头上加大饲料和养殖产品质量安全监督检测力度，严格饲料和养殖产品市场准入，严把生产、经营、使用3道关口，严肃查处违法违规行为，同时加强市场的监督抽查、抽检力度。