瘤胃保护性蛋氨酸和细菌脂多糖对肉牛的营养代谢和激素水平的影响

摘要：一般来讲，单胃动物机体在发生炎症时对含硫氨基酸的需求有进一步增加的迹象，这是因为含硫氨基酸可利用其所带的甲基，对有毒物或药物进行甲基化而起到解毒的作用，因此对单胃动物追加蛋氨酸可缓解机体负氮平衡。本文从反刍动物着手，选取

20头安格斯杂交肉牛用来评估日粮中添加革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)和蛋氨酸对其氮平衡、血清激素、血清蛋白、血清尿氮和血清氨基酸的影响。其中没有添加革兰氏阴性菌脂多糖的组用(−LPS)表示，低剂量的用(+LPS)表示；没有添加蛋氨酸的用(−MET)表示，（+MET）表示添加了14 g/d的瘤胃保护性蛋氨酸。当肉牛适应了粗饲料（DM=1.4%/单位体重）后的14d对其添加MET，然后在饲喂MET后的第1d和第3d分别对肉牛注射2 μg/单位体重和1 μg/单位体重的LPS。在饲喂LPS前采集肉牛血液样本，之后在饲喂LPS的2, 4, 6,8, 10, 12和 24 h后分别采集其血液样本。饲喂5d内收集未被采食的饲料和粪便以及尿液等样本。结果显示，+LPS组较−LPS组的肉牛直肠温度和血清皮质醇浓度、血清激素、血清蛋白、肿瘤坏死因子-α都有所增加，T4（四碘甲状腺原氨酸）和T3（三碘甲状腺原氨酸）有所下降（P < 0.01)。+LPS组的血浆尿氮含量和−LPS组有显著差异（P = 0.03)。在LPS或者 Met组中血清IGF结合蛋白质类的含量差异不显著(P ≥ 0.26)。+LPS组中血浆中Thr, Lys, Leu, Ile, Phe, Trp, Asn, Glu, Orn等氨基酸的含量较−LPS组有所下降，血浆中的Ala有所增加，Gly和Ser含量在初始时有所增加，之后有所下降（+LPS：-LPS，LPS × h; P ≤ 0.04）。整个实验的干物质采食量（DMI）变化不是很明显，但+LPS组较−LPS的DM消化率有所减少(P = 0.04)。各处理组的氮采食量、粪氮排泄量和氮消化差异不显著(P ≥ 0.24)，但+LPS组的尿氮排泄量(P < 0.01)有所增加，尿氮保留有所减少(P< 0.01)。另外从LPS × Met的互作效应来看，当给肉牛注射LPS时，在对其追加蛋氨酸不能提高生长育肥牛氮的利用率，+LPS组肉牛血浆中必需氨基酸的下降说明当肉牛机体在应对某种毒素时，其作为免疫应答对这些氨基酸的需求有所增加。

1 材料和方法

1.1 实验动物日粮和分组

选取初始体重为262 ± 6.3 kg的杂交安格斯肉牛20头，牛棚地面铺2.54cm的橡胶，可以用自来水自动冲洗。所有的肉牛在上午7:00和晚上19:00饲喂1.4%单位体重（以DM为基础）的粗日粮（表1），自由饮水，整个实验时间持续19d，在饲喂粗饲料的14d内所有的肉牛基本适应了该种日粮。其余的5d为收集样品期。其中没有添加革兰氏阴性菌脂多糖的组用(−LPS)表示，低剂量的用(+LPS)表示（Steiger 等, 1999)；没有添加蛋氨酸的用(−MET)表示，（+MET）表示添加了14 g/d的过瘤胃保护性蛋氨酸。本实验中对肉牛添加14 g/d 的MET（DL-蛋氨酸含量≥70%，过瘤胃保护性蛋氨酸≥90%），该MET每天的瘤胃最小吸收量为7.9g，其中MET早、晚7点各饲喂7g。在饲喂MET的第1d后，也就是在整个试验进行的第15d，在肉牛饲喂3h后对其注射2 μg/单位体重的LPS，注射速度为1mL/min（LPS溶于无菌盐水中）。该步骤在饲喂MET的第3d后，也就是在整个试验进行的第15d重复一次，不过LPS的注射剂量减半（1 μg/单位体重）。对于−LPS组的肉牛，将对此注射同等剂量的无菌盐水作为对照组。

表1 粗日粮成分和营养水平

注：1）ME, Mcal/kg = (4.103 - 0.0446 × %ADF) × 0.82 (Harlan 等,1991)。

2）NE_m, Mcal/kg = 1.37 × ME - 0.138 × ME² + 0.0105 × ME³ -1.12 (NRC, 2000).

3）NE_g, Mcal/kg = 1.42 × ME - 0.174 × ME² + 0.0122 × ME³ - 1.65(NRC, 2000).

1.2 样本收集

饲喂MET和注射LPS后的5d内，每24h一次收集肉牛的粪便，然后将其冷冻备用。收集试验第14-18d的未被采食的日粮以及第15-19d的动物粪尿，其中尿液用装有600ml 3 M HCl溶液的20L的真空袋通过输尿管取得（HCI主要是为了降低氨气浓度）。将所有的粪和尿称重，然后取10%的粪样本和1%的尿液冷藏。

在注射LPS的当天，测量牛直肠温度（从注射前开始测定，每隔2h测定一次，一直持续到注射后的12h），同样的从注射LPS前开始取肉牛静脉血±8 mL，之后在注射后的第 2, 4, 6, 8, 10, 12和 24 h后各取一次。血液在室温下静置30分钟，然后分离血清，之后将上层血清置于10°C的冷冻离心机（1,500 × g）中离心20分钟，将离心后的血清和血浆样本迅速冷藏备用。

图1 +LPS组和-LPS组肉牛直肠温度对比

1.3样本数据测定

日粮、未被采食的日粮和粪便样本在55°C的鼓风干燥箱中烘干，然后在2-mm目下过滤，将过滤后的底层样本在105°C对流烤箱中烘烤24h以用来测定DM值。样本中的N含量用N的燃烧值来计算。用比色法测定血液和尿液中的尿素氮含量（饲喂LPS的第0, 2, 4, 6, 8, 10和12h）。取4 μL的血浆（尿液）加入200μL的脲酶反应剂混合均匀（振荡器混合15s），然后置于37°C反应5分钟，之后用全自动定量酶标仪（340 nm）读取数据。测定血清皮质醇、血清三碘甲状腺原氨酸（T3），血清甲状腺素（T4），肿瘤坏死因子-α（TNFα）和IGF-1。

2 结果

LPS组肉牛的直肠温度、血清TNFα, T4, T3, 血清皮质醇、血清促乳激素和血清蛋白值在不同的饲喂时间上差异显著(P < 0.01，图1)，+LPS组的肉牛在注射LPS后的0-2h的直肠温度要比-LPS组的高，且在注射LPS后的2-8h直肠温度一直较-LPS组的低，在注射LPS 10-12h+LPS组的肉牛直肠温度开始降低，且该时间段两组肉牛的直肠温度没有显著差异。+LPS组的2h血清皮质醇较-LPS组有所增加（图2），且在整个样本采集期，+LPS组的血清皮质醇含量一直比-LPS组高。+LPS组的血清催乳激素（图2）和TNFα（图3）在注射LPS后有极大的增加，2h后开始有所下降，6h后两组没有显著差异。在整个样本收集器，+LPS组的甲状腺素（T3 和 T4，图4）一直比-LPS组的低。+LPS组 和 −LPS组的肉牛血清蛋白在0-10h之间没有显著差异，12h后，+LPS组的血清蛋白较−LPS组的有较大幅度大提高（图5）。在肉牛日粮中添加LPS或者Met对肉牛血清中IGF-1的含量没有太大的影响(P ≥ 0.26，表2)，+LPS组的血清尿素氮比−LPS组的的要高(P = 0.03).

图6为LPS × Met × h互作对血浆蛋氨酸含量的影响图。数据显示，在注射LPS前，+MET组 比 −MET组的血浆蛋氨酸含量要高，但注射LPS后，+MET组的血浆蛋氨酸含量开始下降，当注射LPS4-12h后，两组的血浆蛋氨酸含量基本持平。

表2各处理组肉牛的血浆中尿氮、IGF-1和His, Val, Cys, Asp, Gln和 Tyr 含量对比表

LPS组中血清中的氨基酸含量如Thr, Lys, Leu, Ile, Phe, Trp,Ser, Gly, Ala, Asn, Glu, 和 Orn在不同的时间段其含量不同(P < 0.01)。在注射LPS 2h后，+LPS 组的血清Thr含量要比−LPS组的高（图7）,4h后+LPS 组的血清Thr 要比−LPS组的低（P < 0.01）。在注射LPS 2h后，+LPS 组的血清Lys含量要比−LPS组的高（P< 0.01）,4h后两组血清中Lys的含量没有太大差异（图7)。注射LPS后的2-12h内，+LPS 组的血清Leu, Ile, Phe 和Trp含量要比−LPS组的低（6h血清Leu含量除外，图7）。在注射LPS 2h内，+LPS 组的血清Gly 和 Ser含量比−LPS组要高，但2-4h后+LPS 组该含量开始下降，且该趋势一直延续到6-12 h(图8; P < 0.01)。在注射LPS 2h时，+LPS 组的血清Ala含量比−LPS组明显增加，且+LPS 组6h血清Ala含量也要明显高于−LPS组，相对而言，+LPS 组的第4, 10, 和 12 h的血清Ala含量比−LPS组增幅有所缓和（图8）。在整个采集期+LPS 组的血清Asn含量都比−LPS组要低（图8， P < 0.01）。+LPS 组的血清Glu含量在初始时比−LPS组要到，从2-4h后开始下降，且4h后两组的

Glu含量差异不显著(图8; P = 0.02)。两组血清Orn含量和Glu含量走势基本类似（图8）。

表2的数据显示，+LPS 组的血清Tyr含量都比−LPS组要低(P < 0.01)，且+Met组的血清Val含量也要比-Met组的低(P = 0.02)。血清中其他的氨基酸如His, Cys, Gln, 和 Asp在各处理组中的差异不显著。

    关于LPS × Met的互作效应，各处理组的DM 和 N采食量, 粪和尿氮排泄没有显著差异(表 3)。另外+LPS 组的肉牛DM消化量(P = 0.04)和干物质采食量DMI(P= 0.13)较−LPS组的要低。各处理组的肉牛的N采食量(P = 0.37)、粪氮排泄量(P = 0.82)和N消化(P = 0.24)没有显著差异，但+LPS 组的肉牛的尿氮排泄量要比−LPS组要高(P = 0.01)，且尿氮存留量要低(P < 0.01)。数据显示，对肉牛追加Met不能影响其氮采食量(P = 0.86)、尿氮的排泄(P 0.88)、氮消化率(P = 0.56)和氮保留(P = 0.61)，但却增加了粪氮的排泄量(P = 0.03)

表3 各处理组肉牛的采食量、氮消化率和氮平衡对比

3 讨论

3.1 LPS的注射对试验结果的影响

数据显示，当给肉牛注射LPS时可提高其血清皮质醇、催乳激素、TNFα、血清蛋白、直肠温度和降低血清甲状腺素，这说明LPS可使得肉牛肝脏蛋白酶活性增强，在一定程度上激活其化学反应。Steiger 等(1999) 和 Waldron等 (2003)通过对肉牛注射LPS后进行研究分析，也得出了同样的结论。尽管传统的观点认为催乳激素是为促进乳腺发育生长，引起并维持泌乳的，但该激素还可刺激淋巴细胞的增值，从而是免疫反应不可缺少的重要组成成分(Arkins等, 1993)。LPS可活化单核细胞、巨噬细胞和血清皮质细胞来改变血清中的皮质醇、催乳激素、TNFα的含量(Tizard,2004), 能够活化单核巨噬细胞系统,促进细胞因子释放,促进补体的活化和抗体的产生,对特异性免疫反应具有调节作用。

人体血清中存在两种主要的甲状腺激素，即T4（四碘甲状腺原氨酸）和T3（三碘甲状腺原氨酸）。T4和T3在血液中大部分与血浆中的甲状腺素结合球蛋白（TBG）相结合。当体内甲状腺功能异常时，T4和T3值也会发生异常。注射LPS后，肉牛血清中的T3 和 T4含量明显下降,因为LPS可引起肝脏产5′-脱碘酶的减少，而5′-脱碘酶主要存在于肝、肾组织中,能催化T4转变为活性强的T3，而LPS通过减少5′-脱碘酶来降低T4向T3的转化速率。(Kahl 等, 2000)。 Cole等 (1994)指出降低血浆中T3浓度的可增加引起牛传染性鼻窦炎的发生机率。之前的研究表明，当给不同动物注射LPS后，其血清中IGF-1的含量有所下降(牛，Elsasser 等, 绵羊，Briard 等, 2000；大鼠，Soto et al., 1998))。 

       肉牛注射LPS后，其血清中Met, Lys, Leu,Ile, Phe, Trp, Gly, Ser, Asn, Glu和Orn 等氨基酸有所下降，这可能和这些氨基酸参与免疫反应有关。通常在动物体内存在某种毒素时，机体对氨基酸的需求进一步增加。目前有关氨基酸对免疫反应的影响报道较少，由于赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸是猪和家禽大多数日粮中的限制件氨基酸，因而研究它们对机体免疫反应的影响具有重要意义。在人类急性炎症期，机体对Phe, Trp, Lys, Cys和 Ser等氨基酸的需求有增加的趋势(Reeds和Jahoor, 2001)，且人淋巴细胞在酶的作用下会优先选择支链氨基酸以满足蛋白和能量需要(Calder, 2006)。

       在注射LPS后血浆蛋氨酸含量明显下降，这可能说明LPS可增强蛋氨酸的转硫作用，这是因为在机体存在毒素的情况下，其代谢对Cys 和S -腺苷甲硫氨酸的需求有所增加的缘故(Li 等, 2007)。Malmezat等 (2000)指出，在体内存在毒素时，Met向Cys的转硫作用将增加80%。LPS的添加可能会降低瘤胃运动速度，从而导致其DMI采食量的下降；+LPS 组的肉牛相对−LPS组其DM消化率有所下降，这可能是LPS可降低瘤胃PH所引起的。

     +LPS 组的肉牛尿氮排泄量和尿氮保留分别比-LPS 组要增加55%和降低145%，这说明LPS对氮平衡产生了负面影响。Cole 等(1986)和Orr 等(1988)研究指出，当给机体接种IBRV可使尿液中氮存留有所减少，氮排泄有所增加。

3.2蛋氨酸添加对试验结果的影响

在注射LPS前，+Met组的血浆蛋氨酸含量较-Met组的要高，这是由瘤胃对过瘤胃保护性蛋氨酸的吸收有所增加所致。当给肉牛注射LPS后，其血清蛋氨酸含量开始有所下降，这说明当体内存在毒素时，蛋氨酸为免疫系统或肝脏解毒代谢所利用。当给肉牛注射LPS时，+Met组和-Met组在牛的氮保留上没有显著差异，这可能和蛋氨酸不是肉牛的第一限制性氨基酸有关。

 4 结论

总的来看，当生长育肥牛体内存在LPS时，对其追加蛋氨酸不能缓解LPS对肉牛代谢的影响，也不能增加氮的利用率，另外当体内存在毒素（LPS）时，机体免疫代谢对氨基酸的需求有所增加，这也是导致生长育肥牛血清中Met,Lys, Leu, Ile, Phe, Trp, Gly, Ser和Asn等氨基酸含量有所下降的最直接的原因。